잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서

틸디피로신 (tildipirosin) 은 macrolide 계통의 항균제로 유럽 및 국내에서는 다양한 식품류에서 잔류허용기준 (MRLs) 이 설정되어 있으나, 일본에서는 잔류허용기준이 설정되어 있지 않다. 현재 틸디피로신의 분석에는 triple quadrupole mass spectrometer에 기반한 LC-MS/MS 방법이 주로 이용되고 있으므로, 이를 기반으로 하는 방법을 개발하였다. LC에서 분리된 시료는 electrospray ionization (ESI) 이온화 방법을 통해서 이온화 하였고, positive ion mode 및 선택성과 감도가 우수한 스캔 방법인 multiple reaction monitoring (MRM)을 이용하였다. 특히 MRM에서 정량 용 transition 한 쌍, 정성 용 transition을 두 쌍 개발하여, 그 신뢰도도 확보하였다. - 틸디피로신의 MRM 적용 시, 개별 fragment ion 형성이 collision energy에 따라 서로 다른 동태를 보이므로, 두 경우 모두 최상의 감도 확보를 위해 개별적인 collision energy 값을 이용하였다. 틸디피로신의 추출 용매로는 가장 높은 추출 효율을 보인 acetonirile를 이용하였는데, acetonitrile 추출액의 다운스트림 질량 분석 시, 공존 물질에 의한 분석 방해가 관찰 되었다. 이에 분석 방해 원인 물질의 제거를 위해 SPE를 이용한 acetonitrile 추출액 중 틸디피로신의 정제를 진행 하였고, SPE 카트리지 고정상으로는 MCX를 이용하였으며, 결과적으로 우수한 회수율과 상대표준편차를 확보하였다. 수립된 시료(쇠고기) 전처리 방법은 다음과 같다. 균질화된 시료 2 g에 acetonitrile 20 mL를 가하고 5분간 진탕 혼합한다. 이를 4 ℃, 7,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상등액을 취하여 감압 건고한다. 잔류물을 methanol 2 mL로 재분산하고, methanol과 물로 precondition된 MCX SPE 카트리지에 loading한다. SPE 카트리지를 5% formic acid 및 methanol을 사용하여 washing 한 후, methanol성 5% 수산화암모늄 용액로 elution한다. 약산성 또는 약염기성 성분은 해당 성분의 pKa 값을 고려하여 극성 추출액의 pH를 조절한 후, 비극성 용매를 이용하여 높은 효율로 분배 정제할 수 있는데, 이를 ion-associated partition이라 한다. 예를 들어, 약산성 물질의 경우, 해당 성분의 pKa 값 보다 추출액의 pH를 2 이상 높이면, 대상 성분은 해리하고, 수용성을 나타내게 된다. 따라서, 여기에 비극성 용매를 가하여, 비극성 방해물질을 제거할 수 있다. 여기에 이어서 추출액의 pH를 해당 성분의 pKa 보다 2 이상 낮추면, 대상 성분은 중성형을 나타내게 되어, 새로 가하는 비극성 용매로 분배 정제할 수 있게 된다. 약염기성 성분은 해당 성분의 짝산의 pKa를 기준으로 pH 조절 작업을 반대로 수행하면 된다. 본 분배법은 그 효율이 월등하나, pH 조절 중 대상 물질의 가수 분해가 발생할 가능성도 존재하므로, 대상 물질의 pKa와 추출액의 pH 차이를 1.5 정도로 하고, 2회 연속 분배를 적용하는 방법도 이용할 수 있다. 나이카바진 (nicarbazin) 은 가금류의 콕시디아증의 치료에 사용되는 약물로 4,4' dinitrocarbanilide (DNC) 와 2-hydroxy 4,6 dimethylpyrimidine (HDP) 의 1:1 혼합물이다. DNC가 생리활성성분이며 체내 흡수를 돕기 위해 HDP와 혼합물로 복용하는 것으로 보고되어 있다. 식육용 닭고기에서 DNC의 잔존량이 HDP에 비해 더 많기 때문에 각국 공정서에서 나이카바진의 잔류허용기준으로 DNC를 지표성분으로 설정하고 있다. DNC의 화학 구조 특성 상, 발색단이 많이 존재하고, MRL값이 200 ppb로 다른 물질들에 비해 높아서 UV 검출기로도 충분히 검출될 수 있는 조건이므로, HPLC UVD 를 대상 분석법으로 선정하였다. 정확한 log Pow 값을 확보할 수 없어서, 비극성 정도에 대한 정확한 확인은 어려우나, DMSO와 DMF에 약간 녹으며 물과 에탄올에는 녹지 않는 용해도 정보를 통해 일정 수준 이상의 비극성임이 확인되므로, 역상 크로마토그래피 적용이 가능하다. 그러나, isocratic 이동상 조건을 이용한 연속적인 시료 분석의 이점을 확보하기 위해서는 DNC의 추출 후에 추가적인 정제를 통한 더 비극성이 큰 물질류의 제거가 반드시 필요하다. DNC 추출을 위한 최적 용매를 선정하기 위해 acetnonitrile, methanol, metyltert-butyl ether, ethyl acetate 등의 DNC 추출 효율을 비교하였는데, acetnonitrile의 추출 효율이 가장 우수했으며, 2회 반복 작업을 통해 거의 완전한 추출 효과를 획득할 수 있었다. Acetnonitrile에 DNC와 함께 추출되는 비극성 물질류는 역상 크로마토그래피 조건에서 전체 분석 시간의 연장을 초래하므로, 추출액을 SPE에 적용시켜서 DNC만을 선택적으로 정제하였다. SPE용 카트리지 고정상으로 OASIS HLB를 이용하였는데, 보편적으로 사용되는 용매인 methanol, acetonitrile만으로는 elution power가 충분하지 않아서, ethyl acetate와 methanol의 혼합용매를 이용하여 DNC 회수율을 개선 시켰다. 특이성은 닭고기에 분석물질을 첨가하여 전처리한 시료 (0.2 mg/kg), 전처리한 닭고기에 최종적으로 분석물질을 첨가한 시료, 닭고기에 분석물질을 첨가하지 않은 공시료를 전처리한 시료를 분석하여 공시료의 크로마토그램 상에 나이카바진 (nicarbazin) 에 해당하는 피크가 검출되지 않음으로 확인하였다. 직선성은 MRL의 0.5 ∼ 5배 농도 (0.1 ∼ 1 mg/kg) 에 해당하는 구간에서 확 인하였다. 회수율과 정량 한계의 확인을 위하여 시료 중 나이카바진 (nicarbazin) 의 농도가 MRL의 0.5, 1, 2 배 농도가 되도록 나이카바진 (nicarbazin) 표준 용액을 첨가한 닭고기 시료의 전처리를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 표준 농도와의 비교를 통하여 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였고, 정량 한계는 크로마토그램 상에서 분석 대상 피크의 신호대잡음비가 10인 농도로 정하였다. 또, 회수율 시험 결과를 통해 정밀도와 정확도도 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였다. 노르제스토메트는 17α-acetate 사슬로 인해 경구 투여 활성이 향상된 progesterone의 합성 유도체이다. 주로 가축의 발정 유도 및 발정 동기화에 사용되는 동물용 의약품이고 사람에게는 사용하지 않는다. 유럽과 일본의 MRL은 각각 0.2, 0.1μ g/kg 정도로 매우 낮게 설정되어 있어 노르제스토메트의 원활한 분석을 위해선 약 0.05 μg/kg 이하의 LOQ를 갖는 고감도 분석법이 요구된다. 노르제스토메트는 지용성 성분으로, 전처리 과정 중 지방을 제거하기 위해 hexane을 사용할 경우, 노르제스토메트 중 일부가 hexane층으로 이동하여 회수율이 떨어지는 문제가 발생한다. 따라서 hexane을 사용하지 않고 matrix성분들을 제거할 수 있는 전처리를 위해 SPE카트리지를 사용한다. 카트리지는 OASIS HLB 카트리지, Bond Elute C18 카트리지, dispersive C18 흡착제를 사용할 수 있다.