잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서

Ion-pair는 이동상에 분자내에 hydrophobic한 group과 이온기가 함께 존재하는 화합물인 ion-pair 시약을 첨가하는데, hydrophobic group은 비극성 고정상에 녹아 들어가고 고정상 표면에 ionic group이 배치되어 분석하고자하는 화합물은 주로 이온교환 그리고 C18의 분배에 의하여 분리가 일어나게 된다. 사용하는 ion-pair 시약의 alkyl chain 길이, 이동상의 pH 및 염 농도에 따라 머무름 시간이 변동되므로 적절한 머무름 특성을 나타내도록 조절도 가능하다. 잔류분석용 HPLC에서 사용하는 칼럼의 충전제는 2∼5 μm 범위의 구형 입자들이며 주로 사용되는 입자의 크기는 4∼5 μm이다. 보다 작은 2∼3 μm의 입자는 주로 짧은 칼럼의 충전제로 LC-MS 및 간섭물질이 적은 검체를 신속하게 분석하고자 할 때 사용된다. 칼럼의 길이는 5∼30 cm 범위인데 가장 보편적인 길이는 15∼30 cm 이다. 보다 짧은 길이의 칼럼을 사용하면 잔류분석에 필요한 분리능을 얻기 힘들고 더 긴 칼럼을 사용하면 이동상을 흘리는데 필요한 압력이 과다하여 기기 안정성 및 degassing 측면에서 실용적이지 못하다. Eddy diffusion (와류확산)은 다경로 현상으로 입자로 충전된 칼럼에서는 피할 수 없는 band broadening의 원인이다. 부정형 (irregular) 보다 구형 (spherical) 입자를 사용함으로써 이를 줄일 수 있다. Mobile-phase mass transfer (이동상 중의 물질이동)는 입자 사이의 공간을 흘러가는 이동상이 입자 표면과의 마찰에 의하여 입자 표면에 가까울수록 유속이 느려지는 이동 속도의 차이인데 낮은 점도의 이동상을 사용하면 어느 정도 줄일 수 있다. Stagnant mobile-phase mass transfer (정체된 이동상 중의 물질 이동)는 이동상이 다공성 입자 내부에 침투함에 따라 나타나는 물질 이동의 차이인데 작은 입자를 사용할수록 내부 침투 길이가 짧아지므로 최소화할 수 있다. Stationary-phase mass transfer (고정상 중의 물질 이동)는 물질의 고정상 침투하는 정도에 따른 이동상으로의 분배 속도 차이를 의미하는데 고정상의 두께를 얇게 함으로써 줄일 수 있다. Longitudinal diffusion (칼럼 축방향으로의 확산)은 GC와 마찬가지로 시간이 경과함에 따라 이동상 중에서 물질의 확산이 커지는 현상이다. HPLC에서의 최적 유속은 GC에 비하여 1/104 정도에 불과하기 때문에 분석 소요시간이 과다하게 소요되므로 실용적으로는 최적 유속보다 매우 빠른 유속에서 가동된다. 이 경우 이러한 확산 현상은 무시가 가능하다. 이상을 정리하면 가능한 한 넓은 표면적에 고정상을 얇게 결합시킨 작은 구형의 다공성 입자로 충전된 칼럼을 낮은 점도의 이동상을 유속을 낮추어 사용하면 최고의 칼럼효율을 얻을 수 있다. 본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 특이성은 공시료 및 플루메타손 표준용액을 가한 시료를 개발된 방법으로 전처 리 및 분석하여 공시료의 크로마토그램 상에 플루메타손에 해당하는 피크가 검 출되지 않음으로 확인하였다. 2) 직선성은 쇠고기 시료에서 정량한계의 1 ∼ 6배 (5 ～ 30 μg/kg) 범위에서 상관계수 (R)가 0.998로 확인하였다. 3) 회수율의 확인을 위하여 플루메타손의 농도가 정량한계의 1, 2배 농도가 되도록 플루메타손 표준용액을 첨가한 시료를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 공시료를 전처리한 뒤 마지막 과정에서 표준용액을 첨가한 시료와의 비교를 통하여 구하였다. 쇠고기에 대한 회수율과 분석오차는 각각 109.2～113.5%와 10% 미만으로 동물용의약품 분석법 기준을 충분히 만족하며 축산물 중 잔류허용기준에 대하여 정확한 적부판정을 수행할 수 있다. 4) 정량한계는 크로마토그램 상에서 대상 피크의 신호대 잡음비가 10인 농도로 정하였다. 본 분석법의 정량한계는 쇠고기에서 5 μg/kg이다.