Cytokinin의 분자 생리학

1980년대 중반은 식물 생명공학에 형질전환기법이 본격적으로 도입된 시기이며 아그로박테리아 T-DNA의 옥신 및 싸이토키닌 합성 유전자는 식물호르몬 유전자의 발현기작을 극명하게 보여준 예이며 이를 이용한 인위적인 유전자 발현에 의한 식물 호르몬 함량을 변화시키려는 시도가 시작되었다. 싸이토키닌 생합성의 첫 번째 단계를 조절하는 ipt 유전자는 식물위 뿌리에 감염되어 크라운골 종양 조직(crown gall tumor)을 형성하는 아그로박테리아(A. tumefaciens)로부터 발견되었다. 종양조직을 생산하는 식물 조직에서 효소 dimethylallyl(DMA) transferase가 싸이토키닌 생합성의 속도제한 단계(rate-limiting step)임을 밝힌 Akiyoshi (1983) 등은 tmr 유전자가 싸이토키닌 합성에 관여하는 DMA transferase를 암호화하여 싸이토키닌 생산과 관련이 있음을 증명하였다. 싸이토키닌은 세포분열에 중심적인 역할을 하며 수 많은 발달 프로그램에 영향을 끼치는 호르몬이다. 따라서 싸이토키닌 결핍식물체가 살아남기란 매우 어려운 일이다. 이러한 특성으로 생합성 및 신호전달에 대한 돌연변이체를 발견하기 어렵기 때문에 싸이토키닌의 조절적 역할의 연구가 많이 지체되어 있는 것도 사실이다. 식물 유전공학 기술의 발달로 외래유전자 도입발현이 가능해지면서 아그로박테리아의 싸이토키닌 생합성 유전자의 이용으로 세포내 싸이토키닌을 증가시키는 것은 먼저 가능하였고 뒤이어 cytokinin oxidase의 클로닝과 더불어 이제는 싸이토키닌 결핍 변이체를 만들어 낼 수 있게 되었다. 세포내 싸이토키닌의 함량을 조절하는 가장 강력한 기작은 싸이토키닌의 새로운 합성과 일단 합성된 싸이토키닌에 대한 cytokinin oxidase의 분해일 것이다. Cytokinin oxidase에 의한 싸이토키닌의 분해는 돌이킬 수 없어서 이들이 어떠한 반응을 거쳐서 다시 싸이토키닌으로 복귀하는 것이 불가능하다. Faiss 등(1997)은 싸이토키닌의 주요 생산 지점이며 잠재적인 신호 기관인 뿌리에서 싸이토키닌의 증가된 생산이 식물의 줄기에서 잎의 노화, 측아 분열조직의 생장같은 발생학적 사건들에 영향을 끼치는지 조사하였다. 이를 위해 조건부로 싸이토키닌을 생산하는 형질전환 담배를 만들어 내었다. 이 식물은 테트라싸이클린 억제 단백질의 농도가 높을 경우 발현이 억제되는 변형된 35S promoter의 조절을 받는 ipt 유전자를 가지고 있다. 전사 억제를 풀면 호르몬 농도가 빠르게 50배 이상 증가한다. ipt 효소의 작용의 결과로 16종의 서로 다른 싸이토키닌 대사체의 농도의 시간대별 변화를 서로 다른 조직에서 조사하였다. Zeatin riboside가 맨 처음 그리고 가장 극적으로 증가되었고 zeatin, dihydrozeatin 및 glucosides 들이 나중에 축적되었다. 싸이토키닌 농도가 증가된 결과는 호르몬 생산 위치에 주로 한정되어 나타났다. 예를 들면 측아에서 ipt 유전자의 억제를 풀게되면 테트라싸이클린을 처리한 곳에서 단 하나의 눈만 자라게 된다. ipt 유전자의 과발현에 의한 노화 지연의 효과는 관상용 식물과 채소 그리고 과일의 저장 기간을 증가 시킬 수 있을 것이라 생각되었다. Li 등(1992)은 ipt 유전자가 과발현시킨 담배의 잘려진 잎이 오랫동안 엽록소를 유지하는 것을 확인 할 수 있었다. Pogány 등(2004)은 CaMV 35S:ipt 유전자로 형질전환시킨 싸이토키닌 과발현 담배의 tobacco necrosis virus(TNV) 감수성을 조사하였다. ipt 도입유전자로 인한 과량의 싸이토키닌은 식물의 노화를 크게 지연시켰다. 바이러스로 인한 necrotic lesion의 수 및 coat protein 함량은 비교식물보다 크게 낮았다. TNV 접종시 싸이토키닌 유전자 발현 담배의 leaf disc는 에틸렌과 에탄(ethane)을 덜 발생시켰는데 이는 높은 스트레스 내성과 낮은 수준의 lipid peroxidation이 일어남을 가리킨다. 대조계통과 비교할 때 형질전환체는 TNV를 감염 시킨 것이나 시키지 않은 것 모두 H2O2 축적이 거의 일어나지 않았다. 식물 노화는 에틸렌, ABA 그리고 싸이토키닌의 변화에 의하여 부분적으로 조정되는 프로그램의 조절을 받는다. 노화가 지연되는 형질전환 식물은 이러한 신호간의 상호작용을 연구하는데 유용하다. 아그로박테리아의 싸이토키닌 합성 유전자 ipt를 노화관련 유전자(SAG12)의 프로모터의 조절을 받게 하여 발현시켜 노화를 지연시키는 데 이용되고 있다. Chang 등(2003)은 petunia(Petunia xhybrida cv V26)를 PSAG12-ipt로 형질전환시켰다. 꽃의 수명이 길어진 두 형질전환 계통을 이용하여 증가된 싸이토키닌의 함량이 페튜니아 꽃잎의 에틸렌 합성과 감수성 그리고 ABA 축적에 미치는 영향을 조사하였다. 이 계통들에서 꽃의 노화는 야생형에 비하여 6~10일 지체되었다. 전사체는 수분(pollination) 후에 증가되었는데 이때 싸이토키닌 축적도 함께 일어났다. 내부 에틸렌 생산은 야생형이나 형질전환체의 꽃 모두에서 수분에 의하여 증가되었으나 이 증가는 ipt 형질전환체에서는 지체되었다. McCabe 등(2001)은 애기장대의 노화 특이 SAG12 프로모터의 조절을 받게한 ipt유전자(PSAG12-Iipt) 형질전환 유전자의 동형접합체 상치의 성숙한 head에서 발달단계와 수확 후 잎이 노화를 크게 늦추었음을 보고하였다. 잎의 노화의 지체 말고도 성숙한 60일 된 식물은 정상적인 형태를 보여 상추머리의 둘레, 잎과 뿌리의 생중량에서 아무런 차이도 보이지 않았다. 질소결핍으로 인한 노화 유도는 형질전환 및 비교식물의 전체 질소량, 질산태 질소의 양 및 생장을 빠르게 감소시켰으나 엽록소는 형질전환 식물의 하층부 잎에서 유지되었다. 수확된 PSAG12-ipt 식물의 head 역시 그 하부 잎에 엽록소를 유지하고 있었다. 형질전환체의 꽃대가 올라오고(bolting) 꽃이 피기 전(preflowering)까지의 후기 생장 기간 동안 잎의 엽록소, 총단백질, 광합성효소 rubisco 함량의 감소가 없어져서 이러한 요소들이 식물 전체에 골고루 분포하게 만들었다. 동형접합 PSAG12-ipt 상치식물은 줄기대가 나오는 것이 약간(4~6일) 지체되고 개화와 상층부의 잎의 조기 노화는 심하게(4~8주) 지체되었다. Huynh 등(2005)은 SAG12:ipt 유전자를 침수 스트레스(flooding stress)에 의하여 유도된 노화를 지연시키기 위하여 애기장대에 도입하였다. SAG12::ipt 및 야생형 식물을 완전히 물에 잠기게 하거나 뿌리를 물에 잠기게 하는 두 종류의 침수 스트레스를 1, 3 및 5 일 동안 처리하였다. 별개의 실험으로 침수 스트레스를 준 야생형 및 ipt 식물의 회복을 비교하였다. Biomass 축적, 탄수화물 및 엽록소 함량 그리고 싸이토키닌과 ABA 함량을 침수 스트레스 및 그 이후 회복단계에 대한 유전형 별 반응을 정량한 결과 침수된 ipt 식물체는 야생형보다 혹은 완전히 물에 잠기게 한 처리보다 더 빨리 그리고 더 많은 싸이토키닌을 축적하였다. 싸이토키닌 축적은 야생형과 비교할 때 엽록소의 유지, 증가된 biomass 및 탄수화물 함량 등 표현형적 적응도 동반하였다. 침수 스트레스에서 ABA 축적은 야생형이나 ipt 식물 모두에서 빠르게 증가하였으나 완전히 물에 잠기게 할 때는 모든 유전형에서 낮은 상태를 유지하였다. Hoth 등(2003)은 박테리아 ipt 유전자의 발현에 의하여 싸이토키닌 함량이 증가된 식물에서 유전자 발현 양상을 조사한 결과 823개의 유전자 발현이 증가되었으며 917개의 유전자 발현이 감소하고 있다고 발표하였다. Hirose 등(2007)은 또한 OsRR6을 과발현하는 형질전환체(OsRR6-ox)들은 뿌리 등이 빈약하게 발달한 왜성 표현형을 나타냈다고 한다. OsRR6 과발현 계통에서 trans-zeatin type 싸이토키닌의 함량이 증가되는데 이는 체내 싸이토키닌 함량의 항상성 조절(homeostatic control)은 OsRR6 신호에 의하여 이루어짐을 암시한다. Cytokinin oxidase/dehydrogenase 유전자의 발현은 OsRR6 과발현 식물에서는 감소하였는데 이는 형질전환 계통에서 싸이토키닌 함량이 증가되었기 때문인 것으로 추정되었다. 이외에도 많은 스트레스 반응 유전자들의 발현이 OsRR6 과발현 식물에서 역시 변경되어 외부에서 처리한 싸이토키닌 외에도 내부에서의 합성으로 증가된 싸이토키닌이 다양한 스트레스에 영향을 끼침을 암시하고 있다. 형질전환체는 아니지만 임목을 대상으로 싸이토키닌과 스트레스의 관계를 조사한 결과는 대기오염에 노출된 입지에서 자라는 침엽수들은 오염되지 않은 곳에서 자라는 것들을 비교하여 침엽의 싸이토키닌 함량이 더 높다는 것이 밝혀졌다(von Schwartzenberg와 Hahn, 1991). 높은 싸이토키닌 함량에 관여하는 각 오염원의 요인을 알아내기 위하여 성숙한 Sitka spruce(Picea sitchensis [Bong.] Carr) 나무들에 잎이 필 때부터 12월까지 3년 동안 S, N 및 산성도를 조합으로 분무 처리한 결과 중성의 질소를 처리한 침엽에서만 아무런 처리를 하지 않은 침엽에 비하여 훨씬 높은 싸이토키닌 함량이 탐지되었다. 황(S)이 첨가되면 첨가된 질소의 효과가 억제되었고 중성 질소를 처리한 침엽은 생물학적으로 활성이 있는 싸이토키닌 함량이 상당히 높게 나타났으며 이 싸이토키닌 들은 사관과 체관을 통하여 수송될 수 있었다. 질소와 황을 조합으로 처리한 경우 상당히 낮은 양의 싸이토키닌이 존재하여 침엽의 싸이토키닌은 침엽수에서 질소 교란의 초기에 하나의 예민한 생물지표로 사용될 수 있음을 가리킨다. 옥신 즉, IAA(indole-3-acetic acid)는 결국 모든 식물생장 및 발달 측면에 영향을 끼치는 필수적인 다기능 식물호르몬이다. 비록 옥신 의존적인 생장이 모든 식물에서 뚜렷하지만 이 호르몬은 식물의 정아부에서 형성되어 다른 곳으로 극성을 띠며 수송된다. 옥신이 뿌리 정단부분에 도달하면 다시 뿌리 끝에서 cortical 및 표피조직을 통하여 재배분된다. 영양생장에서 옥신은 식물의 줄기 및 뿌리의 한쪽 면으로 수송된다. 그 결과 재배치되는 바로 아래의 줄기 및 뿌리부분의 세포들이 신장된다. 그 결과는 빛, 중력 끌림 혹은 잠재적인 부착지점을 향한 굽힘이다. 생명공학연구를 비롯한 실제 응용연구나 현장 적용시험에서 값이 비싸고 열에 불안정한 IAA가 사용되는 경우는 거의 없다. 인공합성 옥신인 IBA, NAA, 2,4-D가 삽목발근, 조직배양시 캘러스 유도 등에 주로 사용된다.