잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서

본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 페노부카브 분석법의 특이성을 평가하기 위하여 공시료와 표준물질을 가한 공시료를 개발된 분석법에 따라 HPLC-FLD로 분석하여 얻어진 크로마토그램을 비교하였다. 페노부카브의 머무름 시간은 21.8 분이었다. 적용된 분석법의 선택성을 평가하기 위하여 각 검량선 작성시 공시료를 분석하였을 때, 주 피크의 정량에 방해를 줄 수 있는 피크는 검출되지 않았다. 2) 직선성은 페노부카브 LOQ의 1 ～ 6 배 농도(50 ～ 300 μg/kg : 쇠고기, 돼지 고기, 닭고기)에 해당하는 구간에서 확인하였다 3) 회수율과 정량 한계의 확인을 위하여 시료 중 페노부카브의 농도가 LOQ의 1, 2 배 농도가 되도록 페노부카브 표준용액을 첨가한 쇠고기, 돼지고기, 닭고기 시료를 각각 5회 반복하여 분석하고, 표준 농도와 비교하여 회수율을 확인하였다. 회수율은 표준 농도(matrix-matched standard)와의 비교를 통하여 CAC/GL 16규정에 적합함을 확인하였고, 정량 한계는 크로마토그램 상에서 분석 대상 피크의 신호대잡음비가 10인 농도로 정하였다. 또, 회수율 시험 결과를 통해 정밀도와 정확도도 CAC/GL 16 규정에 적합함을 확인하였다.였다. 질파테롤 (zilpaterol)은 β-adrenoceptor agonist로써 소의 사료 섭취효율 개선 및 체중 증가를 위해 사용된다. 잔류허용기준은 한국, 미국 및 일본에서 설정하고 있다. 락토파민 (ractopamine) 역시 β-adrenoceptor agonist phenolethanolamine으로, 사료 섭취 효율을 늘리고 체단백량을 늘리고 체지방을 줄이기 위하여 사료에 5-20 mg/kg feed으로 섞어 돼지에 급여한다. 소의 경우 섭취효율을 개선하고 몸무게 증가를 위해 10-20 mg/kg을 주입한다. EU 내에서는 식품생산동물에서의 사용을 금지하고 있으나, 한국, 미국, 일본, CODEX에서는 사용을 허가하거나 잔류허용기준을 설정하고 있다. 클렌부테롤 (clenbuterol)은 β-아드레날린 수용체에 선택적으로 결합하여 교감신경을 흥분시켜 기관지 확장, 기관지 평활근 이완과 기도 저항성 감소를 유도한다. 자궁의 평활근 세포막에 있는 β2-아드레날린성 수용체에 선택적으로 결합함으로써 자궁의 이완(수축억제 작용)이 일어난다. EU, 호주 등은 클렌부테롤 염산염은 말에서 기관지 확장제, 또는 임신 소에서 분만시기 조절을 위한 자궁이완제로서 사용을 허가하고 있다. 우리나라를 포함한 일부 국가에서는 클렌부테롤의 약효상 체지방 저하 및 체단백 증진 효과를 발휘하기 때문에 식용동물에서 오남용 가능성이 높고 심장독성이 강해 사용을 금지하고 있다. 클렌부테롤은 비유전독성 물질이며, 평활근종을 유발할 수 있고, 사람에 대한 독성으로는 기관지 확장을 일으킬 수 있다. 현재 우리나라는 동물용의약품으로 사용이 허가되어 있지 않으며, 잔류허용기준은 불검출로 설정되어 있다. CODEX에서는 각 국가가 자궁이완제 또는 호흡기 질환 보조치료제로 허가한 경우에 대해서 잔류허용기준을 제시하고 있다. 위의 세 성분은 모두 β-아드레날린 작용제로써 분자 내에는 방향족 환과 이중결합 등의 발색단이 존재하여 UV 검출기에서 검출될 것으로 예상된다. 그러나 잔류허용기준 이하로 분석하기 위해서는 ng/mL 수준의 매우 낮은 농도를 검출해야하므로, 선택성과 감도가 높은 LC-MS/MS를 이용하였다. 내부표준물질로는 각 성분의 중수소 치환체를 사용하였다. 단백질의 산가수분해 및 제거를 위해 perchloric acid (HClO4)를 첨가하여 vortexing하였다. 세 물질의 pKa는 대략 9.5로써 산성에서 positive ion으로 존재하게 된다. 이것을 유기용매로 추출하기 위해서는 neutral form으로 만들어 극성을 낮출 필요가 있다. 세 성분 모두 염기성 조건에서 극성이 낮아지기 때문에 sodium hyroxide용액을 가하여 pH를 12로 조정하였다. 이후 비극성 유기용매인 ethylacetate를 가해 vortexing하고 5000 rpm에서 원심분리하였다. 극성이 낮아진 대상물질들은 water보다는 ethylacetate층에 더 많이 분배되게 된다. 이를 2번 반복하여 추출률을 높였다. 본 분석법은 다음의 항목을 통해서 검증되었다. 1) 특이성은 공시료 및 질파테롤, 락토파민 및 클렌부테롤 표준용액을 가한 시료를 개발된 방법으로 전처리 및 분석하여 공시료의 크로마토그램 상에 각 대상성분에 해당하는 피크가 검출되지 않음으로 확인하였다. 2) 직선성은 질파테롤의 경우 2.0∼40.0 μg/L, 락토파민의 경우 5.0∼100.0 μg/L, 클 렌부테롤의 경우 0.2∼4.0 μg/L 범위에서 상관계수 (R2 )가 0.99로 확인하였다. 3) 회수율의 확인을 위하여 질파테롤, 락토파민의 경우 농도가 잔류허용기준의 0.5, 1배 농도가 되도록, 클렌부테롤의 경우 불검출 기준이므로 정량한계의 1, 2배가 되도록 표준용액을 첨가한 시료를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 공시료를 전처리한 뒤 마지막 과정에서 표준용액을 첨가한 시료와의 비교를 통하여 구하였다. 세 성분에 대한 회수율과 분석오차는 각각 97.8-110.7%와 10% 미만으로 동물용의약품 분석법 기준을 충분히 만족하며 축산물 중 잔류허용기준에 대하여 정확한 적부판정을 수행할 수 있다. 기기분석을 수행한 검체액에 대하여 다른 특성이나 분석원리를 이용하여 기기분석 결과를 재확인하는 정성적 과정이다. 앞서 언급한 바와 같이 정제액이라 하더라도 다수의 간섭물질이 여전히 포함되어 있으므로 GC와 HPLC에서의 머무름 시간과 같은 간단한 크로마토그래피적 정성법으로는 분석 결과의 신뢰도를 보장할 수 없는 경우가 많다. 즉 대상성분의 peak와 머무름 시간이 거의 동일한 간섭물질이 혼입될 가능성이 많으므로, 분리 특성이 상이한 추가의 크로마토그래피법이나 다른 분석법을 이용하여 기기 분석 결과를 재확인하도록 요구되어 진다. 그러나, LC-MS(/MS)나 GC-MS(/MS)를 이용하여 기기분석을 수행한 경우, 해당 질량분석기의 강력한 정성 분석 능력을 인정하여, 추가적인 재확인 과정이 요구되어 지지 않는다. GC를 이용하여 잔류분석을 수행할 수 있는 화합물 대상을 이해하는 것은 검체 추출 및 정제과정과도 밀접한 관련이 있으므로 매우 중요한 사항이다. 즉 검체 추출 및 정제과정의 선택은 해당 기기분석 시 제거하여야 할 간섭물질에 의하여 결정되므로 분석기기의 선택에 따라 잔류분석의 전체 과정이 좌우된다. GC로 분석할 수 있는 화합물은 휘발성 유기 화합물들이다. 무기 화합물들은 극히 일부를 제외하고는 대개 휘발성이 없으므로 대상 화합물이 아니다. 여기서 휘발성이라 함은 보통 화학에서 언급하는 휘발성 수준은 아니다. GC로 분석이 가능한 화합물의 휘발성의 범위는 약 10-7 mmHg (10-9 Pa)까지도 확대될 수 있다. 따라서 일반적으로 비휘발성이라고 인식되는 화합물들도 상당수가 GC로 분석이 가능하다. 특히 휘발성의 해리하지 않는 비극성 화합물이 GC를 통한 분석에 유리하다.