잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서

1) 특이성은 double blank 시료, 공시료, 네오마이신 표준용액을 가한 시료를 개발된 방법으로 전처리 및 분석하여 double blank 및 공시료의 크로마토그램 상에 네오마이신에 해당하는 피크가 검출되지 않음으로 확인하였다. 2) 직선성은 쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 우유, 계란 시료에서 네오마이신 MRL의 0.5배～5배 농도범위 에서 확인하였다. 3) 회수율의 확인을 위하여 네오마이신의 농도가 잔류허용기준의 0.5, 1, 2배 농도가 되도록 네오마이신 표준용액을 첨가한 시료를 각각 5회 반복하여 분석하였다. 회수율은 공시료를 전처리한 뒤 마지막 과정에서 표준용액을 첨가한 시료와의 비교를 통하여 구하였다. 대표 축산식품 6종에 대한 회수율과 분석오차는 각각 81.15～97.25%와 10% 미만으로 CAC/GL 16 규정을 충분히 만족하며 축산물 중 잔류허용기준에 대하여 정확한 적부판정을 수행할 수 있다. 4) 정량한계는 크로마토그램 상에서 대상 피크의 신호대 잡음비가 10인 농도로 정하였다. 본 분석법의 정량한계는 쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 우유, 계란의 경우 0.2 mg/kg으로 국내 잔류허용기준 농도의 1/2이하이며, 벌꿀의 경우 0.025mg/kg으로 국내 잔류허용기준 농도의 1/4정도이다. 퀴놀론계 항생제는 물, 에탄올, 무수에탄올에 녹지 않고 알칼리성 수용액에 잘 녹는 성질을 가진다. 퀴놀론계 항생제는 서로 유사한 활성기인 pyridone carboxylic acid를 가지고 있으며, 4-quninolone necleus와 3번 위치의 carboxyl기를 공통으로 가지고 있다. 또한 6-fluoro와 7-piperazino기를 가지며, 1-nitrogen 및 piperano기의 변화에 따라 다양한 유사구조를 가지고 있다. 특히 옥소린산은 7, 8번 위치의 methylenedioxy기에 의해 다른 퀴놀론 항생제들과 구별된다. 전처리는 식육 부분과 우유로 이분화하여 수행되었다. 식육은 trichloroacetic acid와 acetonitrile로 제단백 (protein precipitation)하고 acetonitrile 포화 hexane으로 제지방하게 된다. 퀴놀론계 항생제들은 pH 6 근처에서 가장 극성이 낮고, 산성조건 하에서는 positive ion을 가져서 좀 더 극성이 된다. Acetonitrile은 유기용매 중에서도 극성이 높은 편에 속하므로 추출이 일어나게 된다. Hexane으로 지방을 제거할 경우 acetonitrile로 미리 hexane을 포화시키는 것이 좋다. 포화시키지 않으면 추출용매인 acetonitrile이 hexane에 소량 섞이게 되므로 추출률이 낮아질 수 있다. 우유의 경우에는 물이 다량 포함되어 있어 acetonitrile로 추출하면 물과 섞이게 되어 추출률도 낮고 질소기류로 농축건고 시키기 어렵다. 그러므로 SPE를 사용하여 우유 내의 분석물질만 카트리지에 흡착시키고 나머지 matrix는 제거할 수 있다. 우선 20% trichloroacetic acid가 포함된 methanol로 제단백하고 고체상추출 (SPE)의 C18 카트리지에 적용하기 위해 0.05M 인산완충용액 (pH 7.4)로 pH를 중성으로 맞추어 준다. 퀴놀론계 항생제들은 중성조건 하에서 극성이 가장 낮으므로 C18 카트리지에 잘 흡착하게 된다. 여기에 물로 세척하여 극성 방해물질들을 제거하고 1% Trifluoroacetic acid in acetonitrile로 용출시킨다. 용출 용매를 산성화시키면 퀴놀론계 항생제들은 중성 환경에서 보다 좀 더 극성이 되므로 용출률이 증가하게 된다. 바시트라신은 폴리펩타이드 계열 항생제로 단일 성분으로 알려져 있었으나 성질이 유사한 동족체 A, B, C, D, E, F1, F2, F3, G 등의 50여개 성분의 합제라고 밝혀졌다. 동족체 성분 중 바시트라신A와 바시트라신B가 바시트라신 약제의 40-60%를 이루는 주성분이다. 바시트라신을 비롯한 폴리팹타이드 계열의 항생제는 발색단(chromophores)과 친수성 구조가 결여 되어 있어, 보고된 화학적인 정성, 정량 기법이 한정적이다. 시료 내에서 해당 성분을 분리해 내기 위한 방법으로 HPLC 와 전기영동 기법이 적용되고 있다. 복잡한 구조를 가진 폴리펩타이드류의 분석에서 이 방법들은 정밀한 결과를 기대하기 어렵다. 현재 국내 시험법으로 HPLC–UV를 이용한 분석법이 있지만 재현성이 많이 떨어지기 때문에 LC-MS/MS를 이용하면 이를 개선할 수 있다. 또한, 바시트라신 동족체의 분자량이 다르기 때문에 LC-MS/MS를 이용할 경우 이들 중 특정 동족체를 선택적으로 분석할 수 있다. 우유의 전처리를 위하여, 우유 5 mL를 원심분리관에 정밀히 달아넣고 20% trichloroacetic acid in methanol 2.5 mL를 가하여 15초간 균질화한다. 이 용액을 1,500 G에서 10분간 원심분리한 후 0.05 M 인산완충용액 (pH 7.4) 12.5 mL을 가하고 1,500 G에서 15분간 다시 원심분리 한다. 상층액을 methanol 6 mL, 물 6mL, 0.05 M 인산완충용액(pH 7.4) 6 mL로 차례로 미리 활성화시킨 C18 카트리지에 흡착시키고 물 3 mL로 세척한 후, 3분간 감압하에서 건조시키고 1% trichloroacetic acid in acetonitrile 6 mL로 용출한다. 용출액은 45℃ 이하의 수욕 중에서 감압하여 농축하고 잔류물은 이동상 2 mL에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 시미아졸은 iminophenyl thiazolidine 유도체로서 진드기 등에 사용하며 주로 양봉 시 살충제로 사용된다. 시미아졸은 현재 국내 및 외국에서 잔류허용기준이 설정되어 있지 않으며, 유럽연합에서는 1999년까지 1.0 μg/g이었으나 현재는 기준이 철회되었다. 액-액 추출법 (LLE, Liquid-Liquid Extraction) 방법을 적용하면 회수율이 약 50% 정도로 낮아 적용할 수 없다. 회수율을 높이기 위해 고체상추출의 HLB와 MAX 카트리지 (Waters사)를 적용하였을 때는 꿀에 함유된 간섭 물질이 거의 제거되지 않는 문제점이 있다. 본 분석법에 사용된 MCX 카트리지 (Waters사)는 cation exchange sorbent를 갖고 있어 약염기성 약물의 양이온을 흡착한다. 용액의 pH를 조절하여 대상 물질을 양이온으로 만들어 흡착시키는 원리이다. 반면 WCX 카트리지 (Waters사)는 용액의 pH를 조절하여 대상 물질이 아닌 sorbent 분자의 상태를 이온형과 분자형으로 조정한다. 그러므로 강염기성을 가진 물질의 경우 사용하며 흡착시에는 염기성 환경을 만들어 sorbent 분자의 상태를 음이온이 되게 한다. 수립된 시료 (벌꿀) 전처리 방법은 다음과 같다. 벌꿀 5 g에 1% acetic acid를 포함한 물 15 mL를 가하고 10분간 vortexing한다. MCX 카트리지에 먼저 5 mL의 methanol로 conditioning 후, 5 mL의 1% acetic acid를 포함한 물로 conditioning 을 실시한다. 그리고 준비해 놓은 시료 용액을 loading한다. 세척과정은 5 mL의 methanol과 5 mL의 1 M HCl 용액으로 실시한다. 새로운 질소퍼지용 튜브에 5 mL의 5% 암모니아 용액이 포함된 methanol로 용리한 후, 50℃ 질소 기류 하에서 건고한다. 이를 1 mL 이동상 (0.2% acetic acid in water/ACN = 80/20, v/v) 으로 재분산 후 syringe filter (0.45 μm)로 여과하여 20 μL를 HPLC-UVD에 주입한다.