잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서

GC-MS를 이용하여 잔류 분석을 수행하기 위해서는 다음과 같은 과정이 필요하다. 먼저 분자이온을 충분히 포함하는 m/z 범위로 MS 조건을 설정하고, 적정한 농도의 표준용액을 GC-MS의 GC에 주입, full MS spectrum을 얻는다. 이 결과로부터 확인될 수 있는 total-ion chromatogram (TIC)는 분자와 fragment 이온의 총합신호를 기준으로 작성되는 chromatogram이므로, 대상 성분에 대한 선택성이 낮다. 따라서, TIC를 직접 대상 성분의 잔류분석에 사용하기 어려우므로, 우선적으로 분석화합물의 머무름 시간에 해당하는 peak로부터 mass spectrum을 추출한다. Mass spectrum으로부터 abundance가 높으면서 분석 화합물의 구조를 잘 반영할 수 있는 이온을 선정한다. 이때, 분자 이온을 선정하는 것이 가장 바람직하나, 일반적으로 EI에서 분자이온은 abundance가 약하여, 이를 선택할 경우, 결과적으로 분석 감도를 떨어트리는 원인이 될 수 있다. 이온화된 분자 및 fragment ion들은 질량분석기 내 자장 (magnetic field) 또는 전장 (electric field) 에 의하여 질량 대 전하 비 (mass to charge ratio, m/z)를 기준으로 분리된다. 질량분석관으로는 quadrupole, ion-trap, double focusing, time of flight (TOF) 방식들이 있는데, 가장 보편적으로 사용되는 것은 quadrupole과 ion trap 방식으로, 이들 방식의 질량 분석 한계 구간이 최대 2,000 m/z 로 그다지 높지 않으나 동물용의약품의 일반적인 분자량이 그 이하인 점을 감안하면 잔류분석에 이로 인한 문제는 없다. Quadrupole 방식은 4개의 hyperbolic rod로 구성되어 있는 구조인데 각 봉에는 직류전위차가 서로 다르게 걸려 있으며, 추가적으로 적용되는 라디오파의 주파수 조절을 통해, 특정 m/z 값을 갖는 이온만을 4중 극자를 통과시켜 검출한다 (나머지는 봉을 때리면서 소멸). 따라서, 주파수를 빠른 속도로 주사하면 각 m/z에 해당되는 이온들이 차례로 검출기에 도달하므로 원하는 화합물의 mass spectrum을 얻을 수 있다. HPLC에서는 단일 조성의 이동상 조건으로 (isocratic) 분석을 수행할 수 있을 뿐 만 아니라 이동상의 조성을 변화시키면서 검체를 분석할 수 있는데 이를 gradient elution이라고 한다. GC에서 temperature programming 법과 같이 분리의 효율이 향상되고 분석시간을 단축시키는 장점이 있다. Gradient 방식으로는 low-pressure mixing과 high-pressure mixing의 2 가지 방식이 있는데 전자는 1개 pump와 switching valve로 2∼4 종의 용매를 교체 유입시키는 방식으로 저렴하나 완벽한 degassing을 요구하는 단점이 있다. 후자의 방식은 혼합하고자 하는 용매 수만큼 pump가 필요하나 사용의 편리성 및 안정성이 우수하다. HPLC에서 주로 사용하는 검체 주입장치는 6-port loop injector이다. 즉 검체 loading 시 정해진 부피의 sample loop (대개 20∼500 μL)에 부분적 또는 전부 검체용액으로 채우며 이때 HPLC는 다른 경로를 통하여 펌프와 컬럼이 연결되어 계속 이동상이 컬럼으로 흐르고 있는 상태이다. 검체 용액을 주입 (inject)하면 HPLC의 이동상 경로가 변경, sample loop를 통과하여 칼럼과 연결되도록 switching 된다. 상용화되어 있는 자동검체주입기 (autosampler)의 기본 원리도 이 범주를 벗어나지 않는다. 잔류 분석용 HPLC에서 주입되는 검체용액의 양은 화합물의 감도와 검체정제 정도에 따라 20∼100 μL 범위인데 이 범위에서 칼럼효율은 크게 저하되지 않는다. 잔류 물질 HPLC의 주류를 이루는 분배 크로마토그래피에서 사용되는 고정상은 일부 polymer를 제외하고는 주로 silica를 support로 하여 비극성 액상물질을 피복하여 사용하여 왔다. 그러나 피복형의 경우 고정상이 이동상 용매에 의하여 일부 용해되거나 고압의 높은 유속을 사용할 경우 전단력 (shear force)에 의하여 벗겨지는 (stripping) 단점이 있다. 따라서 최근의 고정상은 silica 표면에 분리를 위한 작용기를 화학적으로 결합시킨 형태 (bonded phase)가 대부분이다. 화학적으로 결합시키는 작용기의 종류는 가장 많이 사용되는 순으로 역상의 경우 octadecyl (ODS, C18), octyl (C8), phenyl, cyanopropyl (CN, cyano, nitrile)기 등이며 순상의 경우 aminopropyl (NH2), cyanopropyl 등이다. 또한 silica support에 기반한 고정상을 이용하는 경우에는 다음의 사항에도 유의하 여야 한다. 첫 째, silica support로는 천연 또는 합성 silica가 사용되는데, 천연 silica에는 정제를 하더라도 금속이 일부 함유되어 있어 순수한 분배가 아닌 흡착, 이온교환 등의 부수적 효과가 나타날 수 있다. 특히 염기성 화합물에 대해서는 tailing 현상을 유발하므로 분석하고자 하는 대상 화합물에 따라 silica base의 종류를 확인하여야 한다. 둘 째, 작용기의 화학적 반응 후에도 입체 장애로 잔존하는 상당수의 silanol 잔기는 약산성이며 친수성이어서 극성 화합물과 상호작용 (특히 염기성 화합물에 대한 이온 교환) 할 수 있고, 흡착의 특성을 보이며, 이동상이 염기 성일 경우에는 가용화에 따른 collapse 현상을 유발한다. 이와 같은 문제점을 방지하기 위해 bonded phase 반응 후 입체장애가 보다 작은 methyl 이나 isobutyl기를 추가로 반응시켜 유리의 silanol 잔기를 최소화하는데 이를 endcapping이라고 한다. Endcapping된 C18이나 C8 column은 사용 pH 범위가 넓고 흡착, 이온교환 및 가용화 특성이 감소하는 장점이 있으나 endcapping 되지 않은 column과 상이한 분리 특성을 보이는 경향이 있으므로 이를 확인, 선택하여야 한다. 한편 endcapping 반응 정도가 커질수록 C18이나 C8 column 내부는 친유성 특성 (hydrophobicity)이 커진다. Endcapping이 잘 된 column에 극성이 높은 화합물 분석을 위하여 이동상으로 100%에 가까운 물을 사용할 경우, 고정상의 높은 친유성으로 인하여 이동상인 물은 충전제를 적시지 못하게 되므로 모든 화합물이 dead time에 용출되거나 용량계수가 매우 작아지는 channeling 현상이 일어날 수 있는데 이를 hydrophobic collapse라고 부른다.