허혈양상화가 허혈된 흰쥐 뼈대근육의 Akt 인산화와 SOD-1 발현에 미치는 영향 document_id A220517035623

세포의 성장과 생존에 중요한 Akt가 인산화되면 여러 세포보호인자들이 유도되어 세포를 보호한다. 허혈양상화는 Akt 인산화를 증가시켜 허혈손상과 세포자멸사를 감소시킨다고 알려져 있다. 또한, 항산화효소 SOD 1는 허혈 및 재관류시 발생되는 활성산소기를 제거하고, Akt 인산화를 증가시켜 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 허혈양상화가 허혈 및 재관류시 흰쥐의 뼈대근육에서 발현되는 Akt 인산화와 SOD 1에 어떤 영향을 주는지 알아보았다. 30주령의 SD계 수컷 흰쥐를 사용하여 대조군과 허혈양상화군, 허혈군, 허혈양상화 후 허혈군으로 나누었다. 허혈양상화는 온엉덩동맥을 혈관집게로 5분 폐색, 5분 재관류를 3회 반복하였고, 허혈은 온엉덩동맥을 4시간 동안 폐색하였다. 재관류 직후와 1시간, 3시간, 24시간 경과시 실험동물을 희생시켜 앞정강근과 가자미근을 적출하였다. Akt 인산화와 SOD 1의 발현은 면역조직화학염색과 Western blot 분석을 이용하여 관찰하였고, 다음과 같은 결과를 얻었다. 허혈양상화는 Akt 인산화와 SOD 1을 대조군보다 증가시켰다. 허혈시 Akt 인산화와 SOD 1은 대조군보다 감소되었고, 재관류 시간이 지남에 따라 증가되었다. 허혈양상화는 허혈 후 재관류된 뼈대근육에서 Akt 인산화와 SOD 1을 허혈군보다 증가시켰다. Akt 인산화와 SOD 1은 앞정강근보다 가자미근에서 더 많이 증가되었다. 이상의 실험결과로, 흰쥐의 뼈대근육에서 허혈양상화는 허혈 후 재관류시 나타나는 Akt의 인산화와 SOD 1의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었으며, 이러한 허혈양상화 효과는 백색근육인 앞정강근보다 적색근육인 가자미근에서 더 크게 나타나는 것을 알 수 있었다. 허혈 및 재관류시 생성되는 산화질소와 초산소기는 Akt를 활성화시킨다. Ushio Fukai 등은 SD 흰쥐의 가슴대동맥 민무늬근육세포에 과산화수소를 처리하면 Akt 인산화가 증가되며, 과산화수소 농도를 증가시키면 p Akt도 증가된다고 하였다. 이들은 과산화수소 처리로 생성된 활성산소기가 Akt를 활성화시켜 민무늬근육세포를 보호한다고 하였다. 그러나, 과도한 과산화수소는 Akt 활성을 억제시킨다고 하였다. Matsui 등은 Akt 활성이 증가된 생쥐의 심장을 허혈시키면 대조군보다 세포자멸사가적게 일어난다고 하였다. Markuns 등은 Akt활성이 뼈대근육세포에서 당합성 및당대사를 조절하여 세포를 보호한다고 하였고, Rommel 등은 뼈대근육의 증식에 Akt가 중요한 역할을 한다고 하였다. 뼈대근육은 구성된 근육섬유의 종류에 따라 허혈손상의 정도가 다르다고 알려져 있다. 앞정강근은 당원대사를 이용하고 쉽게 피로해지는 백색근육섬유로, 가자미근은 산화대사를 이용하고 피로에 대한저항력이 큰 적색근육섬유로 주로 이루어져 있다. Woitaske와 McCarter는허혈된 생쥐의 긴발가락폄근이 가자미근보다 사립체와 근육원섬유 손상이 크며, 근육섬유의 종류가 허혈손상에 중요하다고 하였다. Seo 등은 4시간 허혈된 흰쥐 앞정강근에서 가자미근보다 세포자멸사가 더 증가된다고 하였다. 본 실험에서 앞정강근에서 p Akt는 허혈양상화 직후 대조군과 비슷하게 관찰되어 재관류시간이 경과됨에 따라 감소하였다. 가자미근에서 p Akt는 허혈양상화 후 재관류 3시간까지 증가한 뒤 감소되었다. 이는 허혈양상화 후 생성되는 활성산소기가 pAkt를 증가시키며, 재관류 시간이 지나면서 활성산소기가 감소됨에 따라 p Akt도 감소되는 것으로 생각된다. p Akt는 가자미근보다 앞정강근에서 적게관찰되었는데, p Akt의 발현이 활성산소기의 양에 의존적이라는 Ushio Fukai 등의 의견을 고려하면, 허혈양상화가 앞정강근에서 더 많은 활성산소기를 생성시킴으로 p Akt의 발현이 적은 것으로 생각되었다. 4시간 허혈 직후 p Akt는 대조군과 비슷하게 관찰되었고, 재관류 1시간에는 대조군보다 감소하였다. 허혈 후 감소하였던 p Akt는 재관류 3시간에 증가하여 24시간까지 대조군과 비슷하거나 증가되었다. 이는 뼈대근육세포를 손상시킬 수 있는 4시간의허혈로 다량의 활성산소기가 생성되며, 이로 인해 재관류 초기에 p Akt가 일시적으로 감소된 것으로 생각된다. 재관류시간이 지남에 따라 p Akt가 증가하는 것으로 보아, 활성산소기가 감소되며 세포가 손상에서 회복된다고 생각할 수 있었다. Noshita 등은 생쥐 대뇌의 허혈중심부에서 p Akt는 재관류 1시간부터 24시간까지 감소되나, 허혈손상이상대적으로 적은 겉질에서는 감소되었던 p Akt가재관류 4시간에 다시 증가한다고 하였다. 이처럼 pAkt는 대뇌의 허혈 구역에 따라 차이가 있는데, 이는 허혈 자극의 강도와 손상정도에 따라 Akt 인산화가 다르게 나타날 수 있다는 것을 시사한다. Kelly등도 활성산소기가 전사인자 등을 활성화시키는 신호전달자의 역할을 하나, 과도한 활성산소기는 세포에 해롭게 작용한다고 하였다. 허혈 후 재관류 초기에 앞정강근보다 가자미근에서 p Akt가 더 증가되었고 대조군과 비슷한 수준으로 관찰된 것으로 보아 가자미근이 앞정강근보다 허혈에 대해 내성을 갖는 것으로 생각할 수 있었다. Tong 등은 허혈양상화가 허혈된 흰쥐의 심실기능 회복과 p Akt를 증가시킨다고 하였고, 허혈양상화 보호효과에 Akt가 중요한 역할을 한다고 하였다. Schroeder 등은 허혈양상화가 1시간 허혈된 흰쥐 긴발가락폄근의 수축력과 ATP를 증가시킨다고 하였다. Mattei 등도 허혈양상화가 뼈대근육의 허혈손상을 감소시킨다고 하였다. 본 실험에서 허혈양상화는 허혈 직후 p Akt를 허혈군보다 증가시켰다. 허혈양상화가 허혈 후 p Akt를 증가시켜 허혈손상을 감소시켜 준다는 Mocanu등과 Kis 등 그리고 Tong 등의실험결과를 고려하면, 본 실험에서 허혈양상화로 증가된 p Akt가 허혈손상을 감소시킬 것으로 생각되었다. 또한 앞정강근보다 가자미근에서 p Akt가 빠르게 증가하고, 발현이 많이 되는 것으로 보아 앞정강근보다 허혈양상화의 보호효과가 더 효과적일 것으로 생각된다. 한편, SOD는 초산소기를 물과 산소분자로 전환시키는 항산화효소로, CuZn SOD와 Mn SOD, extracellular SOD가 알려져 있다. Noshita 등은 SOD 1이 지속적으로 발현되는 생쥐의 대뇌를 허혈하면 대조군보다 신경세포의 세포자멸사가 적게 관찰되며, 재관류 초기에 pAkt가 빠르게 증가된다고 하였다. Wang 등도SOD 1이 발현되는 생쥐의 심장을 허혈시키면 대조군보다 경색의 크기가 감소하며, ATP가 2.1배 증가된다고 하였다. SOD 1이 활성산소기를 제거하고 생성을 억제시킬수 있으며, 대뇌나 심장에서 허혈손상을 감소시킨다는 여러 실험결과를 고려하면, 본 실험에서 허혈양상화를 함께 실시한 허혈군에서 허혈군보다 SOD 1이증가된 것은 뼈대근육에서도 허혈양상화가 허혈 후SOD 1을 증가시키며, 이로 인해 세포손상이 감소될것이라 생각하였다. 또한 SOD 1이 더 많이 증가된가자미근에서 허혈손상이 적을 것이라 생각된다. 허혈양상화만 시행한 가자미근에서는 p Akt가 앞정강근보다 감소된 것으로 관찰되었는데, 이는 SOD 1이더 많이 분포하는 가자미근에서 활성산소기가 적게생성되고 빨리 제거되므로 p Akt가 적게 관찰된다고 생각되었다. 또한 허혈 직후 앞정강근에서 p Akt가 증가된 것도 이와 같은 이유로 설명할 수 있다. 허혈양상화는 허혈된 가자미근에서 p Akt와 SOD1을 허혈군보다 증가시켰으며, p Akt와 SOD 1은 앞정강근보다 높게 관찰되었다. 또한 p Akt와 SOD 1은 재관류 직후 증가되어 3시간까지 높게 유지되었는데, 뼈대근육의 허혈손상이 재관류 3시간에 시작되어 재관류 6시간에 대부분 끝난다는 Blaisdell의 의견을 고려하면 재관류 초기에 높게 유지되었던 Akt와 SOD 1이 초기에 주로 일어나는 허혈손상에 대해 효과적으로 작용할 것이라고 생각된다. 이상의 실험결과로, 흰쥐의 뼈대근육에서 허혈양상화는 허혈 후 재관류시 나타나는 p Akt와 SOD 1의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었으며, 이러한허혈양상화 효과는 백색근육인 앞정강근보다 적색근육인 가자미근에서 더 크게 나타나는 것을 알 수있었다. 앞으로 DNA 분절이나 세포자멸사를 확인하여 Akt와 SOD 1의 증가가 세포손상에 직접적으로어떤 영향을 주는지 확인하고, Akt 신호전달의 아래경로인 Bad와 허혈손상을 감소시키는 eNOS 등에대한 실험을 계속하여 허혈양상화가 뼈대근육에서어떤 보호효과를 유도하는지 더 연구해야 될 것이라고 생각하였다.