HT-3 자궁경부암 세포주에서 새로운 광감작제인 9-Hydroxypheophorbide-a와 670 nm 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 in vivo 연구 document_id A220517035657

국내에서 개발된 광감작제로 녹조류인 Spirulina platensis에서 추출하여 만든 광감작제 9 hydroxypheophorbide a를 이용하여 자궁경부암 세포주인 HT 3에서 새로 개발된 9 HpbD a 광감작제의 임상적용을 위하여 국내에서 개발된 670 ㎚의 다이오드 레이저를 이용한 광역학치료의 항암효과 및 치료기전을 확인하고자 본 연구를 시행하였다. 광감작제는 금호 생명과학연구소에서 녹조류의 클로로필을 산화반응과 산 처리를 통해 10 hydroxypheophytin a 유도체로 만든 다음 이를 유기용매를 이용하여 추출한 10 hydroxypheophytin과 10 hydroxypheophytin a 유도체를 유기합성 후 안정된 구조 및 대량 수율이 가능한 9 hydroxypheophorbide a를 사용하였다. 세포주는 인체의 자궁경부 편평세포암주인 HT 3을 사용하였다. 암세포가 이종 이식된 누드마우스 모델에서 광역학치료를 시행하여 항암효과를 확인하였다. 누드마우스에 이종 이식된 종양의 크기가 약 400 500 ㎣에 도달하였을 때, 제1군은 정상 대조군으로 하였고, 제2군은 9 HpbD a 으로만 처치한 군으로서 9 HpbD a를 DPBS 용액으로 희석하여 누드마우스의 꼬리정맥에 100 μL 투여하였다. 제3군은 레이저 치료만을 시행한 군으로서 다이오드 레이저의 barefiber tip을 이용하여 총 500 mW의 에너지를 종양의 상방과 종양을 중심으로 4방향에서 각각 15분간 조사하였다. 제4군은 제2군에서 시행한 방법으로 9 HpbD a를 종양 내에 투여하고 제 3군에서와 같이 총 500 mW의 에너지를 종양에 레이저를 조사한 광역학치료군이다. 레이저 조사 시에는 온도센서를 이용하여 종양 내의 온도변화를 기록하였다. HT 3 세포가 이종 이식된 누드마우스 모델에서 광역학치료는 아무른 처치를 하지 않은 정상대조군인 제1군, 9 HpbD a만을 누드마우스에 투여한 제2군 그리고 670 nm 다이오드 레이저만을 종양조직에 조사한 제3군 모두에서 종양조직이 지속적으로 성장 하였다. 제 4군인 광역학치료 군에서는 총 20마리의 누드마우스에서 15마리는 완치, 3마리는 재발, 2마리는 치유되지 않았음을 확인하였다. 광역학치료 후 정상조직, 아무른 처치를 하지 않은 HT 3 세포주 종양 조직, 광역학치료 과정인 종양조직 및 완치된 종양조직을 광학현미경으로 비교 관찰하였는데 H E염색에서 종양조직은 전형적인 편평상피암종임을 확인하였고 광역학치료 중인 조직에서는 전체적인 크기만 줄어들었지 암세포의 형태학적 변화를 보이지는 않았다. 또한 이들 조직에서 p53 과 Ki 67의 발현정도를 비교하여 광역학치료의 예후인자로서 의의가 있는지를 보고자 하였는데 정상조직과 광역학치료로 완치된 조직에서는 p53과 Ki 67의 발현이 관찰되지 않았으며, 이종이식된 종양조직과 치료 중인 조직에서의 p53과 Ki 67의 과발현이 관찰되었고 두 군간의 발현정도는 차이가 없었다. 본 연구에서 이용한 9 HpbD a가 기존에 사용하고 있는 1세대 광감작제를 대신하여 효과적인 광감작제로 사용되기 위해서는 종양조직에만 많은 양의 광감작제가 선택적으로 축적되게 하여 광역학치료의 효과를 높여야 하며, 9 HpbD a의 독성능 시험을 비롯하여 현재 사용 중인 항암제와의 병합요법에 대한 연구 및 9 HpbD a를 이용한 광역학진단 연구를 토대로 새로운 광감작제와 함께 인체 조직의 침투력이 좋은 우수한 레이저의 개발도 함께 이루어져야 할 것으로 사료된다. 최근 초경 연령이 낮아지고 첫 성 경험의 연령이 낮아지면서 20 30세의 가임 연령층에서 자궁경부 상피내암과 침윤성 자궁경부암이 발견되는 빈도가 점차 증가하고 있다. 따라서 이 연령층의 여성에서는 자궁경부암의 치료뿐만 아니라 차후 임신과 분만에 관한 사항이 중요한 문제로 대두되고 있다. 이처럼 자궁을 보존해야 하는 가임기 여성에서 자궁경부 상피내종양의 치료 방법으로는 원추절제술과 루프환상투열요법과 같은 수술적 방법과 냉동요법, 전기요법, 고주파치료법 및 레이저 제거술과 같은 국소 파괴요법이 있으며 이들 각각의 성공률은 90 98%로 보고되고 있다. 그러나 여러 학자들의 이러한 치료법들이 높은 치료성공률에도 불구하고 Leiman 등은 가임기여성에게 시술하였을 때 제거된 자궁경부의 기질의 파괴를 초래할 수 있으며, 자궁경부가 길이 2 cm 이상 또는 용적이 4 cc 이상 제거되면 시술 후 불임, 자궁경관 무력증, 조기 유산, 조산, 조기 양막파수 및 분만 시 자궁경부의 협착으로 인한 난산의 위험성이 높고 진통 시간도 길어지며 제왕절개술의 빈도가 높다고 보고하였다. 또한 자궁경부 상피내종양의 발생에 중요한 역할을 하는 인유두종바이러스의 완전 치료가 어렵다고 알려져 있다. 따라서 가임기여성에서 증가되고 있는 자궁경부 상피내종양의 발생빈도를 고려해 볼 때, 높은 치료 효과를 가지면서 자궁경부의 정상적인 조직과 구조를 유지하여 잠재적인 수태능력에 거의 영향을 끼치지 않는 새로운 치료법으로 광역학치료가 등장하게 되었다. 질, 외음부 또는 자궁경부에 생기는 부인과적 암은 보통 레이저 빛을 조사하기 쉬운 위치에 많이 발생하므로 비침습적 시술인 광역학치료는 정상 조직의 손상 없이 암 병변만 선택적으로 치료할 수 있다는 장점 때문에 임신을 원하는 젊은 여성, 수술에 대한 고위험 환자 및 수술을 거부하는 환자 등에게 유용한 치료법이라고 할 수 있다. Hematophorphyrin 유도체를 근간으로 하는 제 1세대 광감작제인 Photofrin과 Photogem은 전 세계적으로 많은 환자들이 광역학치료를 받았고 긍정적 결과를 보였으며, 부인과적으로도 Muroya 등은 96%의 완치율을 보고하기도 하였다. 국내에서도 한 등이 젊은 여성에서의 중증 자궁경부 이형성증에서 HpD를 이용하여 좋은 성적을 보고하였으나, 이 등은 자궁 경부 원추절제술과 비교하여 차이가 없음을 보고하였다. 하지만 많은 환자치료에서 사용한 Photofrin과 Photogem은 최대 흡수파장이 630 nm로 종양조직의 침투에 한계가 있고 체내 배설시간이 길다는 단점과 치료 후 피부에 광선과민증을 장시간 유발하는 등의 단점이 있어, 최근에는 더 좋은 반응성을 가지고 체내에서 빠른 대사를 보이는 chlorophyll 유도체를 이용한 광감작제가 개발되어 이들의 물리화학적 특성과 작용기전에 대한 많은 연구들이 이루어지고 있다. 본 연구에서 사용된 광감작제는 녹조류인 Spirulina platensis의 chlorophyll a로부터 금속 이온을 제거한 피오파이틴 a와 이의 phytol기를 가수 분해시켜 개발한 9 hydroxypheophorbide a로서 기존의 HpD 광감작제가 갖는 체내에서 배설되는데 시간이 오래 걸리는 단점을 줄여 체내의 누적을 방지할 수 있는 장점이 있다. 또한 광감작제의 최대 흡수파장이 높아지면 이러한 광감작제에 맞는 레이저를 선택하여야 하는데 가시광선 영역에서 높은 파장의 레이저일수록 조직에 침투되는 깊이가 깊어져 광역학치료의 효과를 높일 수 있는데, 기존의 HpD광감작제가 630 nm 영역의 최대 활성을 보여 조직 안까지 침투정도가 한계가 있는 반면 9 HpbD a의 최대 흡수파장은 670 nm로 기존의 광감작제보다 높은 파장의 레이저를 사용할 수 있는 장점을 가자고 있다. 본 저자들의 이전 연구에서 HT 3 자궁경부암 세포주에서 클로로필 유도체인 9 HpbD a의 세포독성능을 검사한 결과 생체 외 실험에서 9 HpbD a의 농도와 레이저의 조사량 그리고 9 HpbD a의 투여 후 레이저 조사까지의 시간 간격이 증가할수록 세포 생존율이 통계적으로 의미 있게 감소하였음을 알 수 있었고, 9 HpbD a의 적정 레이저조사시간은 15분, 광감작제를 투여하고 레이저조사시간까지의 배양시간은 최소 6시간 이상임을 확인하였다. 또한 이전연구에서 9 HpbD a와 세포 내 소기관에 특이적으로 염색하는 형광시약을 이용하여 HT 3의 세포 내 축적을 확인한 결과 9 HpbD a의 경우 미토콘드리아, 라이소좀에는 축적이 많이 있지 않았고 소포체에 많은 축적이 이루어진 것을 확인하였다. 이는 HT 3 자궁경부 편평세포암 세포주에서 9 HpbD a를 이용한 광역학치료에서 소포체가 관여하여 세포사멸 기전이 일어남을 시사한다. 9 HpbD a가 소포체에 많이 축적되어 광역학치료 후 소포체에 직접적으로 손상을 주지만 소포체를 제외한 다른 세포 내 소기관에도 9 HpbD a의 축적이 이루어져 이로 인해 광역학반응에도 관여할 것으로 사료된다. 이번 연구에서 Nude mouse에 이종이식된 종양의 광역학치료는 치료효과를 높이고 종양 내 광감작제 치료농도를 유지하기 위하여 광감작제를 직접 종양 내에 주입하였고, 670 nm 다이오드 레이저와 barefiber tip을 이용하여 500 mW cm2의 세기로 총 300 J cm2의 에너지를 종양의 상방과 동서남북 네 곳으로 나누어 조사하였다. 치료된 종양이 완치되는 경우 치료 2주 후부터 종양의 크기가 줄어들기 시작하고 종양 변연부의 종양성장도 관찰할 수 없었다. 이번 연구에서 비록 실험군의 대상 수가 적지만 종양의 광역학치료군에서 완치율 75%의 우수한 항암효과를 보였다. 그러나 종양의 재발 또는 치유가 되지 않은 군의 종양에서는 공통적으로 종양 변연부에서 종양이 성장하는 것으로 보아 광역학치료 시 종양 변연부 치료도 중요시 고려해야할 사항이라고 사료된다. 본 연구에서 정상 조직, 종양조직, 광역학치료 후 종양조직이 줄어들고 있는 조직 그리고 완치된 조직에서 H E 염색을 통해 형태학적인 변화를 현미경적으로 관찰하였는데, 전형적인 자궁경부 편평상피암종임을 확인하였고 광역학치료를 시행하여 줄어들고 있는 종양조직의 가피 아래 부분에서 다수의 염증세포와 괴사조직들이 관찰 되었다. 이는 광역학치료에 의한 조직학적인 변화를 보여준다 하겠다. 결과 도출을 위해 실시한 p53 단백과 세포증식능 표지자로의 ki 67 발현에 관한 연구에서 종양억제 유전자인 p53 유전자는 정상세포에서 발현되는 53k dalton의 핵인산 단백으로 염색체 단완에 위치하는 것으로 알려져 있다. 야생형 p53유전자가 종양억제 유전자로서 ras 및 retinoblastoma 유전자 등과 함께 정상세포의 성장과 분화에 중요한 역할을 한다고 여겨지고 있다. p53이 돌연변이나 대립인자의 소실이 일어나면 돌연변이형 p53이 되는데 이로 인해 p53 유전자가 비활성화되고 암 발생의 억제력을 상실하게 되어 암 유발에 관여한다고 알려져 있다. 정상인 야생형 p53 단백의 반감기는 수분정도로 짧은데 반해 돌연변이형 p53의 생성물은 p53 분자구조를 변화시켜 세포내에서 고도의 안정된 단백을 축적됨으로서 반감기가 수 시간으로 연장되어 면역조직화학염색으로 그 과발현 정도를 측정할 수 있게 되었다. 쉽게 얻을 수 있는 파라핀 포매조직을 이용한 면역조직화학염색법은 p53 유전자의 과발현을 진단하는데 값이 싸고 비교적 간편해 임상적으로 진단적 유용성이 보고된바 있다. p53 유전자 변이와 임상적 예후 인자, 즉 조직학적 유형, 임상병기, 종양의 크기 또는 전이 여부 등과 상관관계가 보고자마다 많은 차이를 보이고 있으며 아직까지 많은 논란이 있다. Ki 67은 Go 기를 제외한 모든 세포주기를 거치는 모든 세포의 핵에 발현되고 세포분열이 끝나면 곧 사라지는 단백으로 이 단백이 발현되는 세포의 분획은 증식기 세포로 정확히 구별되기 때문에 세포의 증식상태를 직접적으로 나타내준다. 따라서 Ki 67 핵 항원은 종양세포의 증식능을 평가하기 위해 항체로 면역조직화학적 염색을 시행하여 평가할 수 있으며 폐암, 악성림프종, 전립선암, 유방종양, 난소암 등에서 악성종양의 예후인자로 의의가 있음이 알려져 있다. 본 연구에서 정상 조직, 종양조직, 광역학치료 후 종양조직이 줄어들고 있는 조직 그리고 완치된 조직의 H E 염색을 통해 형태학적인 변화를 관찰하고, p53 과 Ki 67의 발현정도를 비교하여 광역학치료의 예후인자로서 의의가 있는지를 보고자 하였는데 정상 조직, 종양조직, 광역학치료 후 종양조직이 줄어들고 있는 조직 그리고 완치된 조직에서 H E염색을 통해 형태학적인 변화를 조직학적 관찰결과, 전형적인 자궁경부 편평상피암종임을 확인하였고 광역학치료를 시행하여 줄어들고 있는 종양조직의 가피 아래 부분에서 다수의 염증세포와 괴사조직들이 관찰 되었다. 이는 광역학치료에 의한 조직학적인 변화를 보여준다 하겠다. 또한 정상조직과 광역학치료로 완치된 조직에서는 p53과 Ki 67의 발현이 관찰되지 않았으며, HT 3 cell의 이종이식된 종양조직과 치료 중인 조직에서의 p53과 세포증식능을 보여주는 Ki 67의 과발현이 관찰되었고 두 군간의 발현정도는 차이가 없었다. 이는 HT 3 자궁경부세포주인 종양이 광역학치료로 치료된 완전관해를 보인경우는 조직학적으로 완치되었다는 것을 보여주며 p53과 Ki 67의 과발현이 광역학치료로 종양 치료 중의 예후인자로는 부적합하다는 것을 보여준다 하겠다. 향후 p53과 Ki 67의 과발현이 갖는 조직학적 유형과의 관계 및 환자의 예후를 직접 연관시키는 보다 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다. 부인과적으로 광역학치료는 자궁경부 상피내암의 치료로서 기존에 시행되었던 방법에 비해 치료 효과면에서 뒤지지 않으며 자궁경부의 기질을 파괴를 최소화한다는 장점이 있어 수태능력을 보존할 수 있어 젊은 여성에서 효과적인 치료방법이다. 그러나 광역학치료는 원추절제술에 비해 시술 전 조직학적 검사를 시행하지 않기 때문에 이전에 진단되지 않았던 미세침윤암을 놓칠 수 있으며 또한 완전히 병변이 치료가 되었는지 확인 하는데 제약이 따른다. 이는 자궁경부 상피내암의 치료로 광역학 치료를 시행하는데 반드시 풀어야 할 과제임에는 틀림없다. 이를 보완하기 위해 광역학진단이 해결방법의 하나로 모색되고 있다. 광역학치료를 시행한 후 다시 광역학진단를 시행하여 자궁경부에 남아있는 잔존병변의 유무를 확인 한다면, 광역학치료 효과를 정확히 평가하고 자궁경부 상피내암의 재발율도 낮출 수 있을 것으로 생각되나 아직까지는 민감도의 확립도 풀어야 할 과제이다. 또한 HPV감염의 치료율에 있어 원추절제술을 시행한 군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않았다고 보고하지만 일부 연구에 따르면 광역학치료가 HPV 감염의 치료율이 기존의 방법보다 높음을 보고하였다. 결론적으로 본 연구에서 이용한 9 HpbD a가 기존에 사용하고 있는 1세대 광감작제를 대신하여 효과적인 광감작제로 사용되기 위해서는 9 HpbD a가 정상세포뿐만 아니라 종양세포와의 작용기전에 대한 완전한 이해가 필요하고 종양조직에만 많은 양의 광감작제가 선택적으로 축적되게 하여 광역학치료의 효과를 높여야 할 것이고, 9 HpbD a의 독성능 시험을 비롯하여 현재 사용 중인 항암제와 병합요법에 대한 연구 및 9 HpbD a를 이용한 광역학진단 연구를 토대로 새로운 광감작제와 함께 인체 조직의 침투력이 좋은 우수한 레이저의 개발이 함께 이루어진다면 이러한 연구를 바탕으로 광역학치료의 치료기전에 대한 이해를 넓히고 부인과암 치료에 효과적인 임상적 이용이 가능할 것으로 사료되는 바이다.