Histone Deacetylase 억제제로 유도된 자궁내막암 세포의 세포증식 억제와 세포자멸사 기전연구 document_id A220517035744

자궁내막암은 최근 급속한 경제 성장에 따른 생활수준의 향상으로 말미암아 평균 수명이 연장되고 점차 발생 빈도가 증가하고 있는 중요한 부인암의 하나이다. 자궁내막암 환자의 70 80%는 암병기 제 1기에 속하며 생존율이 비교적 양호한 경과를 보이지만 진행암 및 재발암의 경우에는 다른 악성 부인과 종양과 마찬가지로 불량한 예후를 보이며, 진행된 암에서의 치료는 지금까지 적절한 약물치료가 없다. Histone Deacetylase 억제제는 악성화되는 과정에 있는 세포를 복구하는 능력을 가진 새로운 항암치료제이다. 그렇지만 HDACIs의 구체적인 작용기전에 대해서는 아직 명확히 밝혀지고 있지 않다. 그러므로 본 연구자는 천연 물질인 NaB와 합성된 HDAC I1을 이용하여 자궁내막암 세포주인 Hec 1A 세포주와 정상자궁 내막 세포주인 THESCs 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보고 세포에 미치는 영향을 분석하여 치료에 유용한지를 알아보고자 하였다. NaB와 HDAC I1 각각 투여 후 자궁내막암 세포와 정상 자궁 내막세포에서의 세포생존율을 알아보기 위해 MTS 분석을 이용하였고, 세포 주기 회로 및 세포자멸사에 관계하는 유전자의 발현을 보기 위해 Western blot analysis를 시행하였다. 세포주기분석은 유세포분석기를 이용하였으며 세포자멸사를 확인하기 위해 DNA fragmentation 방법을 이용하였다. Caspase의 활성도를 확인하기 위해 면역형광 염색을 시행하였다. 자궁내막암 세포에 NaB와 HDAC I1을 농도별로 처리하여 24시간 후의 결과에서 농도 및 시간 의존적으로 증식억제의 증가를 보였으나 정상 세포에서는 성장 억제 효과는 보이지 않았다. 세포 주기분석에서 자궁내막암 세포에 투여 시 subG1 주기의 지연이 농도가 증가할수록 증가하였으나, 정상 자궁내막 세포에서는 세포주기의 변화가 없었다. 세포자멸사의 증거인 DNA 분절 검사를 시행하여본 결과 자궁내막암 세포가 NaB에 의해 농도가 증가할수록 세포분절현상이 증가되는 것을 확인하였다. p53, p21, p27, FAS와 FAS ligand 단백은 농도가 증가할수록 발현이 증가하였고, CDK2와 cyclin A의 발현 감소를 확인하였으며, 미토콘드리아에서 세포자멸사에 관계하는 Bcl2는 감소하였으나 Bax 단백은 반대로 발현 증가를 보였다. 비활성 형태의 pro caspase 3과 8 단백질의 양적 감소, caspase 9의 활성과 PARP cleavage의 증가되어 세포자멸사로 유도되는 것을 알았다. caspase 7과 3의 활성도 검사에서도 면역형광으로 활성이 증가하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과를 통해 NaB와 HDAC I1이 자궁내막암 세포에 내인성과 외인성의 세포자멸사의 경로를 거쳐 세포주기와 세포자멸사에 관련된 유전자들의 발현에 영향을 미침으로써 자궁내막암 세포의 증식을 억제하여 결과적으로 세포자멸사에 이르게 함을 알았으며, 향후 자궁내막암의 치료 약물로서의 가능성을 보인다고 생각된다. 자궁내막암은 미국이나 유럽의 여러 선진국에서 높은 발생빈도를 보이고 있는 부인 암으로서 우리나라에서는 다른 여성 생식기종양 특히 자궁경부암에 비하여 비교적 낮은 빈도를 보이고 있다. 그러나 최근 급속한 경제 성장에 따른 생활수준의 향상으로 말미암아 평균 생명이 연장되고 점차 발생 빈도가 증가하고 있는 중요한 부인암의 하나로 자리 매김하고 있다. 자궁내막암 환자의 70 80%는 암병기 제 1기에 속하며 생존율이 비교적 양호한 경과를 보이지만 진행암 및 재발암의 경우에는 다른 악성 부인과 종양과 마찬가지로 불량한 예후를 나타내게 된다. 지금까지 cisplatin, doxorubicine 그리고 paclitaxel의 등장으로 치료에 많은 효과를 보았으나 치료 반응률은 70% 이하이며, 반응기간도 4 8개월 이하로 진행된 암에서의 치료는 지금까지 적절한 약물치료가 없는 실정이다. 최근 세포 복구 능력이 탁월한 HDACIs들이 새로운 항암치료제로 부각되고 있고, 백혈병, 피부암, 대장암, 전립선암, 유방암, 폐암 그리고 자궁경부암에 효과 있는 것으로 보고 하였다. HDAC 억제제 계열의 하나인 NaB는 기존의 항암제와는 달리 독성이 적은 천연물질이면서도 강력한 세포 증식 억제 기능을 가지고 있어 새로운 항암치료제로서의 가능성 타진이라는 관점에서 주목을 받고 있다. 그렇지만 HDAC 억제제의 구체적인 작용기전에 대해서는 아직 명확히 밝혀지고 있지 않다. 본 연구에서는 천연 물질인 NaB와 합성된 HDAC I1을 이용하여 자궁내막암 세포주인 Hec 1A 세포주와 정상 자궁내막 세포주인 THESCs 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보고, 그 작용기전을 분자 생물학적 방법으로 증명하고자 하였다. 먼저 NaB와 HDAC I1에 의한 자궁내막암 세포의 증식억제 효과를 알아보기 위하여 각 각 농도별, 시간별로 투여하였다. NaB의 경우 Hec 1A세포에서는 농도 및 시간 의존적 증식 억제를 보였으나, 정상 자궁내막 세포인 T HESCs 세포에서는 억제를 보이지 않았다. HDAC I1의 경우 자궁내막암 세포주인 Hec 1A 세포에서 시간 및 농도 의존적으로 증식억제 효과를 보였으나, 정상 자궁내막 세포인 T HESCs 세포에서는 억제를 보이지 않았다. 그러므로 이 두 약제 모두가 정상 자궁내막 세포에는 영향을 주지 않는 것으로 확인 되어 예방이나 치료에 있어 좋은 약제임을 증명하였다. NaB와 HDAC I1 투여가 세포주기에 미치는 영향을 조사하기 위하여 자궁내막암 세포와 정상 자궁내막 세포에 농도를 증량하면서 24시간 후 세포주기를 분석한 결과, NaB와 HDAC I1 모두에서 자궁내막암 세포주에서 subG1 주기의 지연 증가를 보였으나 정상 자궁내막 세포주에서는 이 모든 약제에 세포주기의 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과로 세포자멸사를 초래하는 subG1 주기의 변화가 자궁내막암 세포주에서 세포자멸사의 정도를 증가시키는 것으로 판단된다. 그러나 정상 자궁내막 세포는 영향을 받지 않는 다는 것이 주목할 만한 사실이다. 세포자멸사를 확인하기 위해 DNA 분절검사를 자궁내막암 세포주인 Hec 1A 세포를 대상으로 시행하여, NaB 투여군에서 농도에 비례하여 분절이 증가됨을 보여 세포자멸사를 확인 하였다. 항암치료 약제들은 다음의 두가지 세포자멸사 기전을 통해 세포사멸을 유도한다. 첫 번째 기전은 세포자멸사가 유도되는 신호전달과정에서 caspase라고 하는 cystein protease가 활성화 되는데 이 효소가 effector caspase인 caspse 3을 활성화시켜 단백질과 DNA 등을 절단함으로써 세포자멸사를 유발하게 된다. 두 번째 기전은 항암치료, 방사선치료와 같은 스트레스 자극으로 활성화되는데, 이런 자극에 의해 cytochrome c와 같은 미토콘드리아단백질이 유리되고, 이어서 Apaf 1, dATP, procaspase 9과 복합체를 형성하게 되고 이것이 caspase 3를 활성화시킨다. 두 번째 기전은 antiapoptotic, proapoptotic members를 포함하는 Bcl 2 family에 의해 기본적으로 조절된다. 본 연구에서는 caspase 3의 활성화와 caspase 9의 활성화가 면역형광 염색과 Wester blot을 통해 증가됨을 확인하여 이러한 경로를 통하는 것을 알 수 있었다. caspase 3는 세포내의 여러 종류의 기질 단백질을 절단한다. 그 중 Poly polymerase 단백질은 DNA 회복과정에 관계되는 핵 내에 존재하는 효소 중의 하나인데, 다양한 유전자독성 물질에 의해 유발된 DNA strand break를 특이적으로 인지할 수 있는 DNA binding단백질이다. 최근 PARP가 apoptosis specific protease를 위한 기질로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 116kD의 PARP는 세포자멸사 동안에 분열되어 85kD 분절로 나눠지는데, 이것이 초기 세포자멸사 반응의 특이적인 지표가 된다. 본 연구에서도 PARP 분절현상은 NaB의 농도가 증가할수록 발현이 증가함을 관찰할 수 있어 세포자멸사가 일어났음을 알 수 있었다. Bcl2는 세포자멸사의 진행과정과 꼭 필요한 조절요소 중의 하나로 28 kD의 세포막 관련 anti apoptotic oncoprotein이다. Bcl2는 미토콘드리아막을 안정화시킴으로써 cytochrome c Apaf 1 pathway의 활성을 방해하는 기전으로 anti apoptotic 단백질 작용을 일으킨다. BAX는 mitochondria stress를 통해 유도된 세포자멸사에 중요한 요소로 작용한다. 미토콘드리아 세포막이 pore protein과의 상호작용으로 미토콘드리아로부터 cytochrome c를 유리시켜 caspase 9을 활성화시키고, 세포자멸사를 위한 caspase activation pathway를 개시한다. 본 연구에서는 NaB 처리에 따른 Bcl2와 Bax의 발현 정도를 확인한 결과 Bcl2 발현은 감소하였으며, Bax의 발현은 증가를 확인하였다. 면역체계에서 세포자멸사의 시작은 death receptor로 불리는 CD95 Fas Apo 1, tumor necrosis factor receptor 1 그리고 TNF related apopto sis inducing ligand receptor 등의 TNF R family와 같은 특별한 수용체에 ligand가 결합함으로써 일어난다. 본 연구에서 death receptor인 FAS와 FAS ligand의 발현 증가가 확인되어 이 경로를 통하는 것을 확인 하였다. 세포주기 조절을 통한 세포의 성장은 적절한 시기의 각기 다른 cyclin dependent kinase의 활성과 비활성으로 조절된다. p21을 포함해서 CDK는 p53에 의존해서 G1 phase의 DNA 손상에 따라 level이 올라간다. 23p27 또한 G1 progression의 억제조절자로 확인되고 있다. p53 은 DNA 손상과 유전적 이상에 대한 세포반응에 주요한 역할을 하는 종양 억제 단백질이므로, p53의 활성화는 세포주기 정지와 DNA 복구 혹은 세포자멸사를 일으킨다. 본 연구에서는 p21과 p27의 발현이 p53에 의존적으로 증가하는 것을 확인하여, 자궁내막암 세포에 대한 NaB의 효과는 p53 의존성 경로를 통해 일어나는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 통해 NaB와 HDAC I1이 자궁내막암 세포에 내인성과 외인성의 세포자멸사의 경로를 거쳐 세포주기와 세포자멸사에 관련된 유전자들의 발현에 영향을 미침으로써 자궁내막암 세포의 증식을 억제하여 결과적으로 세포자멸사에 이르게 함을 알았으며, 향후 자궁내막암의 치료 약물로서의 가능성을 보인다고 생각된다.