소아에서 다중 역전사효소 PCR법, 직접면역형광법, 쉘바이알배양법을 이용한 호흡기 바이러스의 검출 document_id A220517035754

호흡기 바이러스 감염의 진단에는 직접면역형광법, 쉘바이알배양법 등이 이용되었다. 최근 12종 호흡기 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 다중 역전사효소 PCR이 도입되어, 이들의 진단적 유용성을 알아보고자 하였다. 2007년 5월부터 7월까지 원광의대병원에 내원한 소아 환자에서 의뢰된 비인두흡인액 275검체에서, DFA 검사결과 에 따라 다양한 바이러스와 형광 반응 정도가 포함되도록 122검체를 선택하여 상품화된 킷를 이용하여 mRT PCR을 실시하였다. 연구기간 중 검사실 정보시스템을 이용하여 SVC와 DFA가 동시에 의뢰된 85검체에서의 바이러스 검출률을 후향적으로 조사하였다. 주요 호흡기 바이러스 7종에 대한 검출률은, DFA와 mRT PCR에서 각각 32.0%와 55.7%, DFA와 SVC에서 32.9%와 40.0%였다. Adenovirus는 DFA에서는 12주, mRT PCR에서는 22주가 검출되었고, DFA와 SVD의 비교에서는 각기 6주와 18주가 검출되었다. RSV는 DFA와 mRTPCR 비교에서 3주와 6주, DFA와 SVC 비교에 각각 13주와 8주가 검출되었다. 호흡기 바이러스 검출률은 mRT PCR, SVC, DFA 순이었으며, adenovirus 검출에는 SVC가, RSV는 mRT PCR과 DFA가 우수하였다. 호흡기 바이러스 검출률에 대하여 Henrickson 등은 mRTPCR 31%, 전통적 배양 16.2%와 EIA를 이용한 항원검사법이 26.9%임을 보고하였으나, Dunn 등은 DFA 음성 검체의 87.1%에서 R mix 배양에 양성임을 보고한 바 있다. 즉, 바이러스 검출률은 대상 환자와 검출방법 및 대상 바이러스에 따라 다를 수 있으나, 일반적으로 예민도는 핵산증폭방법, 배양법 및 항원검사법 순으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서도 주요 호흡기 바이러스 7종에 대한 검출률은, DFA와 mRT PCR에서 32.0%와 55.8%, DFA와 SVC에서 각각 32.9%와 40.0%를 나타내어, mRT PCR, SVC, DFA 순으로 검출률이 감소함을 확인할 수 있었다. 특히, 본 실험에서 각 방법에 사용된 검체량이 mRT PCR은 DFA의 1 10, SVC는 절반에 미치지 못한 점을 감안하면, 검출 예민도의 차이는 매우 크다 할 것이다. 이는 mRT PCR이 바이러스의 생존과 검체보존 및 검체량 등에 의한 제약을 적게 받으면서, 대상 핵산을 효율적으로 증폭할 수 있다는 장점이 있기 때문인 것으로 생각된다. 주요 호흡기 바이러스 7종 이외의 바이러스를 포함할 경우 검체의 73.0%에서 mRT PCR 양성을 나타냈는데 DFA와 SVC에서 사용 가능한 항체 종류와 비용을 생각할 때 mRT PCR의 높은 예민도와 다양한 바이러스 검출능은 매우 중요한 장점으로 생각되었다. 본 연구에서는 검사 방법에 따라 ADV와 RSV 검출률에 차이가 관찰되었다. 각 방법의 비교에서 ADA의 검출에 있어 mRT PCR과 SVC가 DFA보다 검출 예민도가 높았는데 이는 본 연구에서 3가지 검사가 동시에 실시된 69검체 중 ADV가 검출된 경우는 18검체이었는데, SVC 17검체, mRT PCR 11검체, DFA 6검체인 결과에서도 확인할 수 있었다. Arnold 등은 DFA에 음성 59검체에서 PCR을 이용하여 ADV를 검출하였고 Landry와 Ferguson은 전통적 배양에 의해서 ADV가 분리된 19검체에서 11검체 만이 DFA 양성임을 보고한 바 있다. 즉, DFA에 의한 ADV 검출은 일반적으로 예민도가 특히 낮아, ADV 감염이 의심되는 경우에는 배양법을 함께 사용할 것을 권장하고 있다. 그러나 배양과 PCR을 비교함에 있어 Jennings 등은 전통 배양법에 의한 1건 양성과 PCR에 의한 10건 양성예를 보고하였고, Freymuth 등은 FluA와 ADV의 검출에서 PCR과 전통적 배양의 차이를 관찰할 수 없었다고 보고하고 있어 보다 많은 검체에서의 확인이 필요할 것으로 생각되었다. RSV 경우 DFA에서 8주, SVC에서 13주가 검출되어 SVC가 높은 예민도를 나타내었으나 mRT PCR과 DFA의 비교에 있어서는 양성 검체수가 적어 검출 예민도를 판단할 수 없었다. Dunn 등은 RSV 양성검체에서 DFA 양성률 94%, R Mix 배양 27%를 보고하였고 Landry와 Ferguson도 호흡기 바이러스 중에서 RSV에 대한 검출률을 DFA 99%, 배양 58.4%로 보고하였는데, 이는 RSV의 환경 노출에 대한 취약성 때문에 검체의 적절한 조작과 신속한 접종을 필요로 하기 때문이다. 따라서 RSV가 유행하는 시기의 호흡기 바이러스 배양에서 검체조작 단계에 보다 주의가 필요할 것으로 생각되었다. 본 연구에서 mRT PCR에 사용한 시발체는 DPO 기술을 적용하여, 일반적인 시발체에 비하여 예민도가 높을 뿐만 아니라 특이도도 높은 것으로 보고되었다. Yoo 등은 호흡기 바이러스에 대하여 DPO 시발체를 사용한 mRT PCR과 DFA에 의한 검출률을 각각 56.0%와 33.0%로 보고하였으며, Roh 등은 하기도 감염 환자의 비인두흡인액에서 mRT PCR과 R mix 배양법을 비교하여 50검체 중 40검체에서 동일한 결과를 보였으나 1검체에서 배양 양성, mRT PCR 음성이었던 데 비하여, 나머지 9검체는 배양 음성, mRT PCR 양성을 보고하였다. 한편, Sung 등은 SeeplexTMRV 키트 검사에 HRVA, HMPV, OC43가 검출된 47검체의 증폭산물 염기서열이 모두 해당 바이러스와 일치함을 보고함으로써 본 방법의 특이도를 확인하였다. 본 연구에서도 비인두흡인액에는 다양한 종류의 핵산이 존재할 것으로 추정됨에도 불구하고, 대부분의 검체에서 전기영동상이 매우 깨끗하여, 일반적으로 알려져 있는 mRT PCR의 단점인 비특이적 밴드 생성과 예민도 감소를 DPO 기술이 보완하는 것으로 판단되었다. 한편, 호흡기 바이러스의 중복감염률은 DFA와 PCR에서 높으며, 일반 세균감염과는 달리 면역이 억제되지 않은 환자에서도 5 10%, 면역억제 환자에서는 10% 이상에 이를 것으로 보고되었으며, RSV, ADV와 FluA 빈도가 높았다. mRT PCR을 이용한 경우 중복감염률은 Yoo 등은 8.0%, Jennings 등은 27%로 보고하였으며, 이는 실제 중복감염과 감염 후에도 존재하는 바이러스 핵산을 검출한 경우를 포함한 것으로 추정되고 있다. 본 연구에서도 19검체에서 중복감염이 검출되었는데, ADV와 PIV 중복감염 2검체는 SVC에 의하여 확인되었고, ADV와 RSV 중복감염 1검체는 DFA와 mRT PCR에 의하여 확인할 수 있었으나, 나머지 16검체는 mRT PCR에서만 검출되었다. 본 연구의 중복감염에서 검출된 바이러스는 모두 40주로써 HRVA 10주, ADV 9주, PIV3 6주, HMPV 5주, FluA 3주, PIV1 2주, RSV 2주, FluB, PIV2과 OC43 각각 1주였다. 최근까지도, 호흡기 바이러스 중복감염의 임상적인 의미는 정립되어 있지 않으며, 호흡기 바이러스의 중복감염은 해당 바이러스의 특성일 수도 있으나, 먼저 이에 대하여 실시간 PCR이나 염기서열 분석 등의 방법으로 확인되어야 할 것으로 판단되었다. 현재까지 호흡기 바이러스 검출에 바이러스 배양이 표준 방법이지만 배양시설이 없는 경우이거나, 배양이 되지 않거나 증식이 현저히 느린 바이러스의 경우 분자생물학적 방법이 권장된다. 그러나 분자생물학적 방법도 고비용뿐만 아니라, 국가기관에서 진단목적으로 인정된 상품화된 제품이 많지 않고, 실제 감염과 잠복감염 및 불활성화 상태의 구분이 불가능하며, 표준화가 완벽하지 못하고, 특히 위양성에 대한 확인이 어렵기 때문에 제한적으로 사용되고 있다. 근래에 SVC는 조기보고가 가능하지만, Carman은 높은 예민도를 나타내는 분자생물학적 검사법에 의한 음성결과의 조기보고가 임상의에게 양성결과 못지않게 중요함을 강조하였으며, Freymuth 등은 대상 바이러스가 다수이며 조기 보고가 가능한 mRT PCR과 예민도는 낮으나 신속보고가 가능한 DFA를 함께 이용하는 방법을 강조한 바 있다. 본 연구에서 mRT PCR의 임상 적용에 있어 일부 검체에서 ADV가 검출되지 않은 점, SVC나 DFA로 확인되지 않은 약한 밴드가 관찰되는 경우, 특히 중복감염 양상으로 밴드가 2개 이상 관찰될 때에는, 판정에 주의가 필요할 것으로 생각되었다. 결론적으로, 호흡기 바이러스 검출에 있어서, DFA는 적절한 검체의 질 및 양과 판독자의 높은 숙련도가 요구되나, 술기가 비교적 간단하여 당일 보고가 가능하며, RSV 검출률이 높았다. mRT PCR은 기술적 난이도가 높고 고가이었으나, 검체 요구조건은 덜 까다롭고, 대상 바이러스가 가장 많고 예민도가 높았다. SVC는 검체 요구조건과 기술적 난이도가 높으나, ADV 검사성적이 가장 좋았다. 따라서, 병원환경에 따라 적절한 방법을 선택하여야 할 것으로 생각되었다.