사람 치수 세포와 치주 인대 세포의 유전자 발현에 관한 비교 연구 document_id A220517035785

본 연구는 사람 치수세포 및 치주인대세포의 차이를 알아보고자 배양한 각각의 세포를 cDNA microarray assay를 통하여 유전자의 발현정도의 차이를 비교하였다. 그 결과를 바탕으로 각각의 세포에서 2배 이상의 유전자 발현의 차이를 보이는 유전자중 특징적인 3가지 유전자를 선택하여 RT PCR로 검증한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. Microarray assay 결과, 치주인대 세포에 비해 치수 세포에서 2배 이상 발현한 유전자 수는 총 51개가 나타났다. RT PCR의 결과, 치주인대세포에 비해 치수 세포에서 ITGA4, TGF β2 등이 높게 나타났다. Microarray assay 결과, 치수 세포에서 비해 치주인대 세포에서 2배 이상 발현한 유전자 수는 총 19개가 나타났다. RT PCR의 결과, 치수 세포에 비해 치주인대세포에서 LUM, WISP1, MMP1 등이 높게 나타났다. 본 연구 결과로 치수세포에는 상아질 형성에 관여하는 특징적인 유전자가 치주인대세포에 비해 높게 발현되었으며, 치주인대세포에는 교원질 합성에 관여하는 특징적인 유전자가 치수세포에 비해 높게 발현되어, 치수세포와 치주인대 세 포는 유전자 발현의 차이가 나타남을 알 수 있었다. 치수조직과 치주인대의 구성성분과 결체조직의 구조는 서로 뚜렷한 차이를 보이나 치근첨의 법랑 백악질 경계부위에서 서로 연결되어 있는 결합조직이다. 치수조직과 치주인대 조직의 기질 성분은 서로 인접한 구조의 세포 활성에도 영향을 미치는 것으로 밝혀졌지만 치수세포와 치주인대 세포 사이의 독특한 상호작용의분자적 특성과 그것들의 유전자 발현에 대한 정보는 거의 없다. 치수세포와 치주인대 세포의 유전자 발현의 차이를 밝히기 위하여 microarray assay를 이용한 연구는 매우 흥미로운 접근방법이라고 생각된다. Cy3로 표지한 치수세포로부터 cDNA를 제작하였고, Cy5로 표지한 치주인대 세포로부터 제작된 cDNA Probe를 8170개 유전자의 microarray로 hybridization시켰다. 치수세포와 치주인대 세포로부터 분리된 mRNA를 이용한 microarray 방법으로 분석한 결과 두 조직 간에 유전자 발현에서 상당한 차이를 보였다. 본 연구에서는 치수세포와 치주인대 세포의 유전자 발현유형사이의 차이를 분석하기 위해 유전자 microarray 방법을 이용하였다. 치아의 치수 및 치주인대 조직으로부터 일차 배양한 치수세포 및 치주인대세포에서 발현되는 유전자의 차이를 알아보고자 Twinchiphuman 8K를 이용하여 cDNA microarray를 시행하였다. 이 방법을 시행하면 두 세포사이의 여러 가지 다른 유전자의 발현정도의 차이를 비교분석할 수 있다. Satchell 등은 apoptosis에 대한 보고에서 치수의apoptosis는 상아모세포층 하방에서 주로 발견되고 치아에 손상 시 상아모세포 수가 현저히 감소하면서 reparativedentin을 형성하는데 관여하며, 치주인대의항상성을 유지하는데 필수적이라고 보고하였다. 치수세포와 치주인대 세포로부터 만든 cell line을 이용한실험에서 치수세포는 dentin sialophosphoprotein이 발현되는 반면, 치주인대 세포는 alkalinephosphatase, osteopontin, 그리고 osteocalin은 나타나는 반면, DSPP는 발현되지 않았다고 보고하였다. Silva 등은 상아질의 광화된 기질내에는 수많은 polypeptides와 signaling molecules가 함유되어 있으며, 치수와 치주인대의 손상 시 분비되어 주위의 세포에 작용하여 치아의 병적인 과정에 영향을 준다고 검토하여, TGF β, BMPs, EGF, IGF, PDGF, FGF, MMP 등이 치주조직과골조직의 형성 및 흡수에 영향을 준다고 하였다. Microarray assay결과 치주인대세포에서 보다 치수세포에서 2배 이상 발현한 유전자 수는 총 51개였으며, 그중Integrin alpha 2와 4, glycoprotein, Neurofilament heavy polypeptide, Connective tissue growth factor, Transforminggrowth factor beta 등이 특징적으로 나타났다. 또한 치배 형성에 관여하며, 치주조직의 개조에 역할을 하는Connective tissue growth factor가 치주인대세포의 증식과 분화에는 영향을 준다는 것은 보고된 바가 있었으나, 치주인대세포에서보다 치수세포에 영향을 준다는 것은 새로이 밝혀진 결과이다. Integrin은 glycoprotein family로서 세포 표면 부착 수용기에 비공유결합하며, 사람 치수세포가 Integrin alpha1, alpha 3, alpha 5, alpha 6, alpha v, 그리고 beta 1을분비하여 생물학적 활성 분자인 laminin과 fibronectin에부착시킨다고 밝혀진바 있다. Neurofilament heavy polypeptide는 신경세포에 특이적인 filament에 나타나며 신경세포의 cytoskeletal plasticity를 조절한다. 치수의 치근단 부위와 중간부위에서는혈관을 함께 동반한 두꺼운 neurofilament nerve bundle이 우세하며, 치관측 부위, 특히 치수각 부위에서는 치수 상아질 복합체 부위에 calcitonin gene relatedpeptide와 substance P에 반응하는 신경섬유들이 분포하고 있다. TGF beta는 유전자 전사과정을 조절하는 기능을 가지고있어서 세포의 성장에 관여하며 세포의 성장과 분화를 조절하는 강력한 인자로 알려져 왔다. 특히 TGF beta는 뼈형성과 치아 형성 시에 작용하는 세포의 분화에 관여하며 TGF beta와 TGF beta receptor가 결합하면 핵에서의 전사 과정을 기시하여 세포의 증식을 조절하는 기능을 갖게된다. Toyono 등은 쥐와 소의 embryonic pulp와adult pulp에서 TGF beta receptor type I과 II, activins, 그리고 BMP가발현됨을 밝혀 치아의 성장과 치수조직의 회복 시 다양한역할을 함을 밝힌 바 있으며, 또한 사람치아의 치수를 면역염색 시 상아모세포층에서 TGF beta receptor I과 II가 강하게 발현되었음을 관찰하였다. 본 연구에서는 세포의 성장을 증진시키며 경조직 형성을 촉진시키는 것으로 알려진 TGF beta II의 발현이 치수세포에서 치주인대세포보다 강하게 나타났다. Microarray assay의 결과를 토대로 치수세포에서 치주인대세포보다 2배 이상 발현한 유전자 중 Integrin alpha4, Neurofilament heavy polypeptide, Transforminggrowth factor beta를 선택하여 RT PCR한 결과에서는NEFH는 치수세포와 치주인대세포에서 차이를 보이지 않았다. Microarray assay결과 치수세포에서 보다 치주인대세포에서 2배 이상 발현한 유전자 수는 총 19개였으며, 그중 치주인대의 항상성에 기여하는 것으로 생각되는 교원질 합성에 역할을 하는 Matrix metalloproteinase 1, 10, Lumican 등은 치수 세포에서보다 치주 인대세포에서 뚜렷하게 나타났으며, 이는 MMP 1과 Lumican을 선택하여 시행한 RT PCR에서도 동일한 결과로 나타났다. 치수조직 및 상아모세포에서 MMP의 분포 및 chemokine과의 상호작용에 관한 보고가 있었으며, 치수세포보다 치주인대 세포에서의 MMP 1의 발현이 현저한 것은 이전의 연구에서 발표되지 않은 결과이다. Small interstitial leucine rich keratan sulphate proteoglycan인 lumican은 발치된 사람치아의 세포성 백악질의 백악아세포를 둘러싸고 있는 lacuna부위와 치주인대 섬유 및 상아질 치수 복합체의 상아세관 및 전상아질에서도 관찰되었다. Microarray assay 결과 중 치주인대세포에서 치수세포에서보다 2배 이상 발현한 유전자인 WNT1 inducible signaling pathway protein 1을 RT PCR한 결과도동일하게 나타났다. 쥐의 cornea stromal cell을 primaryculture한 세포의 유전자 발현을 관찰한 연구에서 myofibroblast는 WNT1 inducible signaling pathway protein 1을 발현시킨바 있다. 본 연구에서는 사람치아의 치수 및 치주인대 조직으로부터 배양한 치수세포와 치주인대 세포에서 발현되는 유전자중 각각에 대해서 2배 이상의 증가를 발현시킨 유전자를 관찰한 결과 치수세포에서 2배 이상 증가된 발현을 나타내는 유전자가 치주인대세포에서 2배 이상 증가된 발현을 나타내는 유전자 수보다 훨씬 많이 나타났으며 그중 상아모세포에서 많이 발현된다고 밝혀진 유전자들 몇 개가 특징적으로 관찰되었다. 반면 치주인대세포에서 치수세포보다 2배 이상 많이 발현되는 유전자수는 상대적으로 적은 수였으며, 그중 치주조직의 항상성을 유지하는 교원질 합성과 분해에 관여하는 특징적인 유전자 몇 개를 관찰할 수 있었다. 비록 Microarray assay method가 치수세포와 치주인대세포에서 나타나는 유전자의 발현의 차이를 관찰할 수는 있지만, 현재는 치수와 치주인대 연구 부분에서 가치가 제한적이다. 그러나 단편적으로 두 가지 다른 종류의 세포에서 어떤 유전자가 어떤 세포에서 정확히 어떤 역할을 하는지에 대해서는 정확히 결론 내리기는 어려우며, 그것들에 대한 더욱 과학적인 검증과 연구가 행해져야 한다. 본 연구 결과는 향후 치수 및 치주 인대의 구성 성분 및 기능과 관련된 유전자 발현과의 복잡한 관계를 이해하는데 기초가 될 것으로 생각된다.