락토바실러스 속 균종의 동정방법 document_id A220623000190

본 발명은 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토바실러스 속 균종에 특이적인 프라이머 및 락토바실러스 속 균종에 공통적인 프라이머를 이용하여 검사체 내의 락토바실러스 속 균주를 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다. 요구르트에서 분리된 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)의 정장효과가 인정되면서 유산균에 대한 관심이 증대하고 이에 따른 연구가 계속적으로 진행되어 왔지만, 국내에서의 유산균 관련 연구는 아직까지 미미한 상태이다. 오래전부터 유럽의 여러 국가에서 유제품 및 치즈 등으로부터 다양한 유산균주가 분리되었으며, 일본에서 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 개발된 이래 다양한 의약품 및 기능성 식품으로써 유산균이 많이 사용되고 있다. 최근에는 미국에서도 장 정착성 및 내산성이 우수한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG의 제품화가 성공한 이후 유산균에 대한 연구는 전 세계에서 활발하게 진행되고 있으며 성인병 예방 및 면역 증강에 의한 항암효과 등이 우수한 기능성 프로바이오틱(probiotic) 유산균의 분리와 개발에 대한 관심이 계속적으로 증폭되고 있다. 프로바이오틱 유산균은 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품, 캡슐제제 등에 사용되고 있으며 향후 프로바이오틱 유산균 개발 기술은 기술 집약형 방식으로 전개되어 이들 제품의 규모는 지속적으로 증가할 것으로 예상된다. 국내 상황도 마찬가지여서 대부분의 균주를 수입에 의존하고 있는 발효유 시장만 놓고 볼 때 2001년 현재 매출은 9,300억원이며 매년 10% 씩 꾸준한 성장세를 보여 2002년에는 12,000억 원대가 될 것으로 추산되어 고기능성 프로바이오틱 유산균주를 이용한 제품의 시장성은 무한하다고 할 수 있다(McCann et al., J. Food. Pretect., 1996, 59, 41-45). 락토바실러스는 간균으로써 호모(homo) 유산발효성과 헤테로(hetero) 유산발효성을 모두 가지고 있으며, 동·식물체 및 발효유제품 등 다양한 분리원에서 발견되는 통성혐기성 균종이다. 락토바실러스는 젖산, 초산과 같은 유기산 생성과 그에 따른 pH 저하에 의한 항균작용과 H2O2와 디아세틸(diacetyl) 등의 항균성 대사산물 및 다양한 단백질성 고분자 물질인 박테리오신(bacteriocin)의 생성에 의해 식품 부패 미생물과 다른 병원성 미생물의 생육을 억제하는 것으로 알려져 있어서 요구르트나 발효유 제조 혹은 건강식품 및 의약품으로도 널리 사용된다. 또한, 락토바실러스의 발효에 의해 생성되는 유기산은 부패 방지를 위한 식품첨가물뿐만 아니라 수술용 제봉사의 원료가 되는 폴리락틱산(polylactic acid)과 그 밖에 아세트알데히드(acetealdehyde), 아크릴릭산(acrylic acid), 2,3-펜타디온(2,3-pentadione) 등 다양한 합성물질의 재료로써 사용된다(Porro et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65, 4211-4215). 지금까지 알려진 락토바실러스 속 균종에는 90 여종이 있으며, 현재 프로바이오틱 균주로써 상용화되고 있는 균주는 일부에 불과하다. 이들 중 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus; L. delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus; L. casei subsp. rhamnosus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 등이 대부분을 차지한다. 이 밖에도 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 존소니이(L. johnsonii; L. acidophilus subsp. johnsonii), 락토바실러스 훼르멘텀(L. fermentum) 등이 최근 기능성 프로바이오틱 균주로 개발되고 있지만 이들은 기존의 프로바이오틱 균종인 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 등과 유사한 균종에 속한다. 락토바실러스에 대한 계통분류학적 분류를 위해 현재까지는 현미경적 소견과 그람염색법, 카탈라제 시험법, 생육 시험법, 당 이용성 등을 포함한 생리특성시험 및 이를 포괄하는 생화학적 방법인 API 시험키트를 이용하였다. 그러나 상기와 같은 분류 방법은 데이터베이스의 한계성을 가지며 재현성이 떨어지고 모호한 동정 결과를 많이 도출하기 때문에 원하는 균주를 특이적으로 동정하기 위한 방법이 절실히 요구된다. 상기와 같은 문제점을 보완하기 위해 분자생물학적 동정 및 특성 분석법을 이용하기 시작하였으며(Tenover et al., J. Clin. Microbiol., 1995, 33(9), 2233-2239, 1995), 최근에는 PCR 및 다양한 전기영동방법 등이 보고 되고 있다(Walter et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(6), 2578-2585). 이 중 현재 많이 연구되고 있는 것은 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA) 분석법으로, 상기 방법은 10개 내외의 염기서열로 구성된 임의의 프라이머(random primer)를 사용한 일종의 유전자지문분석(fingerprinting) 기법이다(Cusick et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 66(5), 2227-2231). RAPD를 이용해서 얻은 유전자지문형(fingerprint pattern)은 게놈 유전자(genomic DNA)에 따라 고유하게 나타남으로써 미생물의 분리, 동정 및 특성 분석이 가능하다(Kaufman et al., Appl. Environ. Microbiol., 1997, 65(4), 1268-1273). 그러나 아직까지는 PCR 조건에 따른 재현성 문제와 속, 종 및 그 이하의 균주간 비교를 위해 적합한 프라이머의 확립이 부족하여 이에 대한 연구가 진행 중이다(Wang et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62(4), 1241-1247). 최근에는 종 특이 프라이머를 이용한 PCR 기법(species specific PCR, 이하 "SS-PCR"이라 약칭함)을 사용하고 있는데, 상기 방법은 게놈 유전자의 특정 부위가 종간 염기서열에 있어서 차이가 있다는 점을 이용하여 종 특이적인 프라이머를 사용한 유전자 증폭을 통하여 특정 종에서만 특이적인 PCR 산물을 생산하게 하는 원리이다(Matsuki et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65(10), 4506-4512). SS-PCR의 주요 대상 유전자로 많이 연구된 것은 16S, 23S rRNA 및 16S-23S rRNA 사이 지역(interspacial region)으로 이들에 관한 염기서열 정보는 다양한 웹기반의 데이타베이스들에 공개되어 있다(Naimi et al., Microbiol., 1997, 143(6), 823-834). 이들 염기서열 내의 변이 지역을 프라이머 대상 부위로 이용하여 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus)를 포함한 유산균 속내의 종 분류가 가능함이 다수 보고 되었다(Angeletti et al., J. Clin. Microbiol., 2001, 39(2), 794-797; Walter et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(1), 297-303). 또한, 장내환경 등 여러 균주가 혼재된 상태에서 원하는 종들의 SS-PCR 프라이머를 혼합하여 사용함으로써 원하는 균주들의 존재 유무를 신속, 정확하게 확인하거나 균주들을 분류, 동정하는 다중 PCR(multiplex PCR) 기법들도 최근 많이 보고되고 있다(Lee, et al., FEMS Microbiol. Letters., 2000, 193, 243-47). 그러나 현재까지 알려진 16S rRNA와 23S rRNA 등을 기반으로 하는 다양한 다중 PCR 방법을 사용하여도 16S rRNA에서의 종특이 변이 지역의 제한성 및 23S rRNA 지역에 관한 정보의 부족과 염기서열 길이의 한계 등으로 단일 PCR 반응을 통한 다수의 락토바실러스 종의 분류 및 동정은 불가능한 실정이다(Song, et al., FEMS Microbiol. Letters., 2000, 187, 167-173). 이에, 본 발명자들은 종 특이적 프라이머를 이용한 PCR 기법을 사용하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 정확하고 간편하게 동정하기 위해 연구하던 중, 다양한 균종의 염기서열 데이터를 바탕으로 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역을 포함하는 염기서열들을 사용하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 공통적 서열 및 균종 특이적 서열을 확보하였으며 이를 이용하여 180 bp에서 1090 bp에 이르는 다양한 크기의 PCR 산물이 생성될 수 있도록 다중 PCR 프라이머 세트를 제작하였다. 이 프라이머 세트를 사용할 경우 단일 PCR 반응을 통하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 간편하고 정확하게 동정할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.