신생혈관형성의 ｓｉＲＮＡ 저해를 위한 조성물 및 방법 document_id A220623011610

신생혈관형성(angiogenesis)은 새로운 모세혈관의 생장 또는 혈관신생(neovascularization)으로 정의되는 것으로 생장 및 발생에서 기본적인 역할을 수행한다. 성인의 모든 조직은 신생혈관형성을 개시할 수 있는 능력을 가지고 있으나 이러한 능력은 엄격하게 조절되고 있다. 신생혈관형성의 주요 조절인자는 혈관내피세포 성장인자("VEGF")이며 이는 혈관투과성 인자("VPF")라고도 불리운다. VEGF는 인간에서 적어도 4개의 다른 선택적으로 스플라이싱된 형태(alternative splice forms)로 존재하고(VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206), 이들 모두는 비슷한 생물학적 활성을 나타낸다. 신생혈관형성은 분비된 VEGF가 혈관내피세포의 표면에 발현된 Flt-1 및 Flk-1/KDR 수용체(VEGF 수용체 1 및 VEGF 수용체 2라고도 불리워짐)에 결합함으로서 개시된다. Flt-1 및 Flk-1/KDR는 막투과성 타이로신 키나제 단백질이고, 이들 단백질에 VEGF의 결합은 세포 내에서 일련의 신호전달 경로를 활성화시켜서 최종적으로 주변조직에서 혈관신생을 유발한다. 비정상적인 신생혈관형성 또는 신생 혈관의 병리적(pathogenic) 성장은 다수의 상태와 관련되어 있다. 이러한 상태는 당뇨병성 망막병증, 건선, 삼출성 또는 젖은형(wet) 노인성 황반변성("ARMD"), 류마티스 관절염 및 기타 염증성 질환, 및 대부분의 암을 포함한다. 이러한 상태와 관련된 질병에 걸린 조직 또는 종양에서 VEGF는 비정상적인 높은 수준으로 발현되고 혈관신생 또는 혈관투과성이 증가되어 있다. 특히, ARMD는 임상적으로 중요한 혈관신생질환이다. 이 질환은 노인의 한 쪽 또는 양쪽 눈의 맥락막에서 신생혈관이 형성되는 것을 특징으로 하며, 산업화된 국가에서 실명의 주 요인이 되고 있다. 비정상적인 신생혈관형성을 저해하기 위해서 많은 치료전략이 제시되어 VEGF의 생성 또는 효과를 감소시키려는 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 수용체 항체 (Kim ES 등 (2002), PNAS USA99: 11399-11404), 및 VEGF와 결합하는 혈관내피세포 수용체와 경쟁적으로 결합하는 가용성 VEGF 포획체 (Holash J 등 (2002), PNAS USA99: 11393-11398)이 개발되었다. 또한, VEGF 유전자 발현을 초래하는 전통적인 VEGF "안티센스" 또는 압타머(aptamer) 치료요법이 제안되었다 (Uhlmann 등의 미국 특허출원 공개 제 2001/0021772호). 그러나, 이러한 치료요법에서 사용된 항-신생혈관형성 제제는 단지 VEGF 또는 VEGF 수용체의 화학량적 감소를 유도할 수 있고, 이들 제제의 효과는 질병에 걸린 조직에서 비정상적인 고농도로 생성된 VEGF에 의해서 감소된다. 그러므로, 이용 가능한 항-신생혈관형성 제제를 이용하여 얻은 결과는 만족스럽지 못하다. RNA 간섭(RNA interference, 이하 "RNAi"로 약칭함)은 많은 진핵생물에서 보존된 전사후 유전자 조절의 한 방법이다. RNAi는 세포에 존재하는 짧은(예, 〈30개 뉴클레오티드) 이중나선 RNA("dsRNA") 분자에 의해서 유도된다 (Fire A 등 (1998), Nature391: 806-811). "소간섭 RNA(short interfering RNA)" 또는 "siRNA"라고도 불리우는 이러한 짧은 dsRNA 분자는 한 개의 뉴클레오티드 변형 내에서 siRNA와 서열상동성을 가지는 전령 RNA("mRNA")의 파괴를 유발한다 (Elbashir SM 등 (2001), Genes Dev, 15: 188-200). siRNA 및 이의 표적화된 mRNA가 "RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex)" 또는 "RISC"에 결합하면 RISC는 표적화된 mRNA를 절단한다. siRNA는 분명히 여러 번 재사용되는 효소와 유사하게 재순환된다. 하나의 siRNA 분자는 약 1000개의 mRNA 분자의 절단을 유도할 수 있다. 그러므로, mRNA의 siRNA-매개 RNAi 분해는 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 현재 이용 가능한 기술보다 더 효과적이다. Elbashir SM 등 (2001, supra)은 짧은 3′오버행(overhang) 말단을 가지며 21 및 22 뉴클레오티드로 이루어진 합성 siRNA는 초파리세포 용혈액에서 표적 mRNA의 RNAi을 유도할 수 있다고 보고하였다. 또한, 배양된 포유동물세포에서 합성 siRNA는 RNAi 분해를 유도하고 (Elbashir SM 등 (2001) Nature, 411: 494-498), 최근에 합성 siRNA에 의한 RNAi 분해의 유도는 살아있는 마우스에서 보고된 바 있다 (McCaffrey AP 등 (2002), Nature, 418: 38-39; Xia H 등 (2002), Nat. Biotech.20: 1006-1010). siRNA에 의한 RNAi 분해 유도의 치료적 목적의 적용 가능성은 최근의 몇몇 체외(in vitro) 실험에서 증명되고 있는데, siRNA 매개에 의한 HIV-1 감염 저해(Novina CD 등 (2002), Nat. Med.8: 681-686) 및 신경독성 특성을 나타내는 폴리글루타민 질환 단백질 발현의 감소(Xia H 등 (2002), supra) 등의 연구를 예로 들 수 있다. 그러므로, 촉매적 또는 아화학양론적 양으로 VEGF 또는 VEGF 수용체의 발현을 선택적으로 저해할 수 있는 제제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 발명의 요약 본 발명은 VEGF, FLT-1 및 FLK-1/KDR 유전자의 mRNA를 특이적으로 표적화하여 이들의 RNAi 유도에 의한 분해를 유발하는 siRNA에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA 화합물 및 조성물은 신생혈관형성을 저해하기 위해서, 특히 암종양, 노인성 황반변성 및 다른 신생혈관형성 질환을 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 VEGF mRNA, 인간 Flt-1 mRNA, 인간 Flk-1/KDR mRNA, 또는 이들의 선택적 스플라이싱 형태(alternative splice form), 돌연변이체 또는 동족체(cognate)를 표적화하는 분리된 siRNA를 제공한다. siRNA는 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 RNA 듀플렉스(duplex)를 형성한다. 센스 RNA 가닥은 표적 mRNA에서 약 19개 내지 약 20개의 인접한 뉴클레오티드로 구성된 표적 서열에 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 및 바이러스 벡터뿐만 아니라, 본 발명의 siRNA와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 siRNA를 대상자에게 유효량으로 투여하여 표적 mRNA를 분해하는 것을 포함하는, 인간 VEGF mRNA, 인간 Flt-1 mRNA, 인간 Flk-1/KDR mRNA, 또는 이들의 선택적 스플라이싱 형태, 돌연변이체 또는 동족체의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 대상자에게 인간 VEGF mRNA, 인간 Flt-1 mRNA, 인간 Flk-1/KDR mRNA, 또는 이들의 선택적 스플라이싱 형태, 돌연변이체 또는 동족체를 표적화하는 siRNA를 유효량으로 투여하여 신생혈관형성 질환과 관련된 신생혈관형성을 저해하는 것을 포함하는, 대상자에서 신생혈관형성을 저해하는 방법을 제공한다.