유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용한 세포표식방법 document_id A220623017136

본 발명은 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용한 세포 표식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전사조절인자나 유전자에 상보적인 RNA를 이용하여 유전자가 순차적으로 발현되게 하는 유전자의 단계적 발현 네트워크 및 이를 이용하여 형광 단백질을 발현시켜 시간에 따라 발현되는 단백질의 종류를 달리함으로써 세포를 표식하는 방법에 관한 것이다. 유전자의 발현 조절은 특정 산물의 수율을 높이기 위해서부터 질병 치료를 위한 유전자 치료에까지 다양하게 이용된다. 기존의 발현 조절은 특정 유전자를 과발현, 혹은 억제하는 방법이 주류이었다. 그러나 이와 같은 단순한 접근법은 한계가 있으며, 수율 증가를 위해서 혹은 치료를 위한 정교한 발현의 조절을 위해서는 여럿 유전자의 복잡한 네트워크를 통해서만 가능하며 최근 이런 접근으로 기존 방법보다 수율을 높였다는 보고가 있다 (Farmer, W.R. and Liao, J.C., Nature Biotechnology, 18, 533-537, 2000). 그 외에도 아직 상업적 목적은 아니지만 유전자 네트워크를 인위적으로 구성해 생체 내 시스템을 다양하게 조절하고자 하는 시도가 지속되고 있다(Benner, S.A. and Sismour, A.M., Nature Rev. Genet., 6, 533-543, 2005; Guido, N.J. et al., Nature, 439, 856-860, 2006; Ferber, D., Science, 303, 158-161, 2004; Guido, N.J. et al., Nature, 439, 856-860, 2006). 현재까지 인위적인 유전자 네트워크 구성을 통해 제작된 생체 조절 시스템으로는, 외부 신호 농도에 따라서 두 개 중 하나의 유전자만 주로 발현되어 스위치 형태를 이루는 것(Sprinzak, D. et al., Nature, 438, 443-448, 2005; Kobayashi, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 8414-8419, 2004; Atkinson, M.R. et al., Cell, 113, 597-607, 2003), 발현이 주기적으로 반복되는 것(oscillation)(Atkinson, M.R. et al., Cell, 113, 597-607, 2003; Garcia-Ojalvo, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 10955-10960, 2004; McMillen, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 679-684, 2002; Elowitz, M.B. and Leibler, S., Nature, 403, 335-338, 2000)으로 다양하다. 이런 유전자 네트워크는 직접적으로는 소량으로 존재하는 물질을 감지하는 바이오센서, 약하게 발현되는 유전자의 검출 등의 세포 자체를 이용한 다양한 분야에 응용할 수 있다. 그리고 세포 자체가 논리 연산 및 수학적 연산을 할 수 있게 만든 보고도 있어(Sprinzak, D. and Elowitz, M.B., Nature, 438, 443-448, 2005; Sharma, V., BioTeach. J., 2, 53-60, 2004; Simpson, M.L. et al., Trends in Biotechnology, 19, 317-323, 2001; Guet, C.a.l.C. et al., Science, 296, 1466-1470, 2002), 유전자 네크워크가 이식된 세포 자체만으로 다양한 분야에 응용이 가능할 것이고, 이에 대한 기대 역시 증가하고 있다. 본 발명은, 발현의 다양한 조절 중 시간차를 둔 단백질의 순차적 발현을 가능케 하는 유전자 네트워크를 구성하여 세포내 단백질 발현을 정교하게 조절하기 위함이며, 이 역시 기존의 다른 유전자 네트워크처럼 세포를 유전공학 기법으로 조작함으로써 다양한 산업 분야로 응용 가능케 하는데 이용할 수 있다. 하나의 세포 타입에 대해서만 연구를 하는 실험자의 경우 세포 개개를 구분하고자 하는 필요성은 적지만, 최근 신약 개발이나, 유전체, 단백질체 연구를 위해 대량의 세포 실험(high-throughput cell-based assay)에 대한 필요성은 급격히 증가하는 추세에 있다. 이런 대량 실험의 경우, 다양한 세포 타입을 한 번에 실험하므로 개개의 세포 타입을 구분하는 것은 매우 중요하다. 세포 타입 구분을 위해서는 일반적으로 하나의 웰(well)에 한 종류의 세포만을 넣는 세포칩(cell-chip) 방식이 널리 이용되고 있다. 이 방법의 단점은 세포칩에 세포를 배양하거나, 실험을 진행하기 위해서는 고가의 실험 장치가 필요하다는 점이다. 이와는 달리 세포에 화합물을 이용하여 각각의 세포에 코드를 주입하는 방법이 새로이 고안되었다(Beske, O.E. and Goldbard, S., Drug Discovery Today, 7, S131-S135, 2002). 이 방법을 간단히 설명하면 주로 세포를 화합물이 포함된 배양액 속에서 배양함으로써 해당 화합물을 포함하도록 하는 방법이다. 이런 세포 자체에 표식을 심는 방법은 세포 구분을 위해 웰에 세포를 넣지 않아도 되며, 모든 종료의 세포가 하나의 웰에 섞여 있어도 구분이 가능하다는 장점이 있다. 현재까지 이런 방법을 위해 이용하는 표식은 색을 낼 수 있는 Quantum dot을 세포 내에 주입하거나, Virtual Array 社 에서 이용하는 방법처럼 색으로 이루어진 바코드 물질을 세포 내로 유입시키는 방법이 대표적이다(Beske, O.E. and Goldbard, S., Drug Discovery Today, 7, S131-S135, 2002; Bruchez, M. et al., Science 281, 2013-2015, 1998; Han, M. et al., Nat. Biotechnol. 19, 631-635, 2001; Chan,W. and Nie, S., Science 281, 2016-2018, 1998) 비록 이런 접근 방법이 세포칩(cell-chip)은 필요치 않으나 단점으로 세포 내부로 세포를 구분 가능하도록 하는 물질을 매번 주입한 후 세포를 혼합해야하는 과정이 존재하는 것과, 색으로 구분 가능한 경우의 수가 매주 적다는 점, 주입된 화합물이 세포에 유해한 경우 사용이 제한되는 점이다. 따라서 현재의 대량의 세포 실험(high-throughput cell-based assay)의 개선을 위해서는 (1) 세포 개개에 표식(코드)을 심는 방법이 필요하며, (2) 표식이 세포에 유해하지 않아야 하며, (3) 다양한 세포의 구분을 위해 구분 가능한 표식의 수가 가능한 많아야 하며 (4) 한번 표식을 이식했을 때 다시 주입할 필요가 없어야한다.