핵산을 안정적으로 보관하는 새로운 피부 유전자 카드와이를 이용한 유전자 분석방법, 그리고 이의 응용 방법 document_id A220623039860

(기술분야) 본 발명은 유전자 분석을 위한 새로운 피부 유전자 카드와 여기에서 DNA와 RNA를 획득하고 각종의 유전자분석을 시행하는 방법, 그리고 이를 응용하는 방법에 대한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명의 발명자들은 인체의 여러 피부나 모발, 점막으로부터 시료를 간편하게 안전하며 신속하게 얻을 수 있고, 채취된 시료 내에 DNA와 RNA가 실온에서 안정적으로 장기 보존 및 우송 가능하게 하는 피부 유전자 카드 (피부 유전자 카드)를 개발하였으며, 이로부터 DNA와 RNA를 얻고. 이렇게 얻은 DNA와 RNA를 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)과 역전사-PCR, 실시간 PCR, 시퀀싱, 혼성화, DNA 칩 분석 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 유전자 돌연변이, 프로모터 메틸화 검색, 유전자발현 검색 등의 다양한 유전자 검사를 모두 수행할 수 있다. 아울러 이들 피부유전자검사를 질병 예측과 영양유전체학 검사, 약물유전체학 검사, 개인 식별 등 법의학적 검사, 유전질환 진단, 각종 피부 질환의 진단 등에 응용하며, 피부나 모발 상태를 객관적으로 평가함으로써 맞춤식 화장품과 피부관리를 하는 시스템을 수립하여 미용과 화장품학, 피부과학 등 임상진료에 실질적으로 이용한다. (종래기술) 인체를 포함한 다세포생물은 수많은 세포로 이루어져 있으며, 세포 중심의 핵에는 유전정보를 보관하는 DNA가 존재한다. 유전정보의 단위를 유전자(gene)라고 하며, 이는 DNA로 구성되어 있다. 세포의 모든 생명현상과 기능은 단백질에 의해 이루어지며, 유전자는 단백질을 만들기 위한 명령체계를 지시 전달하는 광대한 정보단위이다. 하나의 유전자는 하나 또는 다수의 특정 단백질을 만드는데 필요한 특수한 암호코드를 가지고 있다. DNA의 모양은 이중 나선구조를 이루고 있고, 각각의 나선가닥에는 염기(base)라고 불리는 수많은 화학구조단위로 구성되어 있다. DNA의 염기에는 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 타이민(T)의 4가지 종류가 있는데, 이 염기의 배열된 순서, 또는 염기서열(base sequence)이 곧 그 유전정보를 결정한다. DNA의 유전정보가 세포질 내에서 단백질 생산으로 나타나기 위해서는 중간 매개물질이 필요하며, 이를 RNA라고 한다. DNA의 유전정보는 일차 mRNA로 바뀌며, 이를 전사(transcription)과정이라고 한다. mRNA의 유전정보는 세포질의 리보솜에서 tRNA와 rRNA의 도움 하에 단백질로 해석(translation)된다. 3개의 염기가 하나의 아미노산을 지정하며, 이러한 3개 염기의 단위를 코돈(codon)이라고 한다. 리보솜에서 1차 생산된 단백질은 해석-후 변형(post-translational modification)을 거쳐 최종적인 활성 단백질로 만들어진다. 세포가 분열될 때 DNA는 똑같이 복제(replication)되어 자손 세포에 전달된다. 한 인간에서 모든 세포의 DNA는 모두 동일하다. 생체 내 모든 세포의 형태, 구조, 기능, 건강 상태 및 발병 여부는 세포에서 발현(expression)되는 단백질의 종류와 양에 따라 결정되며, 이는 다시 어떤 유전자의 RNA가 어느 정도 전사(transcription)되느냐에 의해 결정된다. 즉, 개개 세포마다 발현되는 유전자의 종류와 양이 서로 다르기 때문에 차이가 생기는 것이며, 실제 각 세포 별로 발현되는 유전자의 백분율은 3～5%에 지나지 않는다 (Aressns J, Armstrong M, Gilissen R, Cohen N. The human genome: an introduction. Oncologist. 2001;6:100-109). 한 생물체가 가지고 있는 모든 유전자의 총체를 유전체 또는 게놈(genome)이라고 한다. 이에 대해 한 개체에서 전사되는 유전자(즉 mRNA)의 총체를 전사체 (transcriptome)라고 하고 발현되는 단백질의 총체를 단백질체 (proteome)라고 한다. 인간 게놈은 30억 개의 염기로 이루어지며, 약 3만개의 유전자가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 최근 인간 게놈 전체의 염기서열을 판독하는 인간게놈프로젝트가 완성되어 유전자를 이용한 난치성 질환의 진단과 치료에 획기적인 발전이 이루어지고 있으며, 소위 맞춤의학, 예측의학의 시대가 열리고 있다. 생명현상은 (1)게놈 DNA의 유전정보, (2)유전자의 전사, (3)발현되는 단백질의 3가지에 의해 결정된다. 최근 이들의 정보를 총체적으로 자동 분석하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이를 위해 특히 마이크로어레이 또는 바이오 칩(biochip)이 도움이 된다. 피부의 경우에도 유전자연구가 최근 활발하게 시도되고 있다. 예컨대 cDNA 마이크로어레이등의 방법을 피부의 생리와 병리, 기능 등의 연구에 이용하려는 시도가 이루어지고 있으며, PCR 등의 방법을 이용하여 피부 감염의 유무와 원인균을 진단하는 데 사용하기도 한다. 유전자검사를 통해 피부의 상태를 정확히 평가하고 피부질환을 더 상세하게 이해하고 진단할 수 있을 것이라는 인식은 있으나, 실지 응용이나 뚜렷한 성과는 보기 드문 상태이다. 피부유전자검사를 맞춤식 피부 치료나 미용 및 화장에도 응용할 수 있을 것으로 보이나 이에 대한 보고도 찾기 힘들다. (Fuller BR et al. Gene array technology and the search for cosmeceutical actives. In In: Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005). 피부유전자검사를 실용화하기 위해서는 해결되어야 할 수많은 문제가 남아있다. 특히 피부의 검체를 어떻게 비침해적으로 적절하게 채취하며, 어떻게 그 유전자를 분석하며, 그 결과를 피부질환 진단과 미용상태 평가, 그리고 맞춤식 피부관리에 실제 응용하느냐에 대한 구체적인 연구가 필수적이다. 본 발명은 이를 해결하려는 데 주목적이 있다. DNA나 RNA시료를 이용한 유전자 연구에 있어서 가장 큰 문제점 중 하나는 이들 핵산이 실온에 두면 급속하게 분해된다는 것이다. 특히 RNA의 경우 분리 과정 중 파괴된 세포로부터 분비되며 환경에서 다량으로 존재하는 리보뉴클레아제 (Ribonuclease, RNase A) 에 의해 대부분이 수시간 내에 급속하게 분해되는 문제점이 있다. 이에 본 발명자들은 키토산을 이용하여 카드나 액체 형태로 RNA와 DNA를 실온에서 안정적으로 장기간 보관이 가능하고 유전자 발현 분석에도 간편하게 사용할 수 있는 방법을 개발하여 특허를 취득하거나 출원중인 상태이다. 아울러 이를 응용한 RNA와 DNA 카드, PCR 및RT-PCR 키트 및 마이크로어레이 용 칩은 다수의 DNA와 RNA 샘플을 보관하고 운반하며 분석하는데 이용되고 있다. 본 발명에서는 이러한 RNA카드를 피부 유전자 검사 키트 개발에 응용하였다. 피부는 성인에서 평균 면적이 1.6m2, 중량은 체중의 평균 16%를 차지하는 가장 큰 기관으로 구조와 기능, 해부 및 생리학적으로 매우 복잡하다. 최근 분자유전학과 단백질체학의 발달에 따라 피부의 구조와 기능, 생리, 노화, 질병 발생의 메커니즘에 대해 많은 새로운 사실들이 밝혀지고 있다. 피부는 외부의 자극이나 위험으로부터 신체를 보호하고 체온 조절 등 주위의 변화에 순응하는 역할을 한다. 그 외에도 피부는 감각, 분비, 배설, Vitamin D 등의 호르몬과 사이토카인 (cytokine)을 생산하는 내분비 기능 및 면역기능, 재생 등의 기능이 있으며, 미용에 있어서는 결정적 역할을 한다. 피부는 바깥 층에서부터 크게 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하조직(subcutaneous tissue)의 독특한 3개 층으로 나누어지고, 부속기관으로 모발(hair), 피지선(sebaceous gland), 땀샘(sweat gland, 에크린선), 모세혈관 등으로 구성되어 있다. 표피는 피부 3개 층 중 가장 얇은 층이나 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 하며, 또한 조직의 수분 소실과 손상을 방어하고 세균 침입도 방지한다. 표피는 주로 각질형성세포 (keratinocyte)로 이루어져 있으며, 그 외에 멜라닌형성 세포 (melanocyte), 랑게르한스 세포 (Langerhan's cell), 머켈세포 (Merkel cell)가 존재한다. 각질형성세포는 기저층에서부터 위로 올라가면서 분화하여 가장 바깥의 각질층을 형성하며, 피부표면에서는 노화된 각질세포가 계속 떨어져 나간다. 각질층은 피부를 방어하는 첫번째의 장벽이 된다. 멜라닌세포는 긴 수지상돌기를 가지고 각질형성세포사이로 뻗어 있으며, 각질형성세포로 전달된 멜라닌은 자외선을 흡수 내지 산란시켜서 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 막아준다. 피부는 기능적으로 볼 때 외계의 해로운 물질이나 자극으로부터 보호하는 장벽이라고 볼 수 있으며, 이러한 피부장벽의 메커니즘과 생리 및 병리를 정확하게 이해하는 것이 무엇보다도 중요하다. 피부 장벽 중 가장 중요한 것은 표피의 각질층이다. 각질 층은 구조적으로 볼 때 각질세포 (corneocyte)와 지질구조로 이루어 진다. 각질 층의 성분은 단백 40%, 수분 40%, 지질 10-20%로 나타난다. 피부장벽을 벽돌담에 견주어 볼 때 각질세포는 벽돌, 그리고 지질구조는 회반죽 역할을 한다. 피부의 습도유지는 건강한 피부를 유지하는 기본 조건이며, 각질층에 의해 1차적으로 이루어 진다. 각질층은 (1) 각질세포가 생산하는 천연보습인자 (natural moisturizing factor, NMF), (2) 각질세포사이에 존재하는 지질층, (3) 교소체 (desmoasome), 그리고 (4) 피지선으로부터 분비되는 피지 등에 의해 수분을 유지한다. 표피지질의 주성분은 ceramide와 콜레스테롤, 자유지방산 (free fatty acid)으로 이루어 진다. 진피는 그 두께가 표피의 15-40배로 피부의 대부분을 이루며 유두진피 (papillary dermis)와 망상진피 (reticular dermis)의 2층으로 이루어져 있다. 진피는 세포들과 결체조직, 세포간 기질 (extracelluar matrix)로 이루어져 있다. 세포로는 섬유모세포와 조직구, 비만세포, 랑거한스세포, 림프구, 형질세포를 포함한 세포들이 존재한다. 아울러 혈관과 림프관, 신경, 기모근과 에크린선, 아포크린 한선, 한관, 모피지 단위, 조갑 (nail) 등의 피부부속기 (skin appendage)가 존재한다. 진피는 표피에 영양분을 공급하며 표피를 지지하고, 피부의 손상으로부터 신체를 보호하며 표피와 상호작용하여 피부를 재생시키고, 수분을 저장하고 체온을 조절하며 감각에 대한 수용체역할을 한다. 진피의 결체조직은 교원섬유와 탄력섬유, 세망섬유 등 섬유가 풍부한 것이 특징이며, 그 주성분은 콜라겐 (collagen)와 엘라스틴 (elastin) 이고, 특히 콜라겐이 가장 많다. 피부에는 1형과 3형, 4, 7, 8형의 5가지 형의 콜라겐이 존재하며, 1형이 80-85%로 가장 많다. 콜라겐과 엘라스틴은 표피 아래에 있는 섬유성 결체조직을 형성하여 표피를 지지하여 탄력성과 유연성을 제공한다. 콜라겐을 분해하는 효소가 존재하며, 그 중 가장 중요한 것이 matrix metalloproteinase type 1(MMP1, collagenase 1)이다. 조직 내에는 MMP1을 억제하는 물질도 존재하며 이를 tissue inhibitior of metalloproteinase (TIMP)라고 한다. 피부 내 콜라겐의 양은 콜라겐 합성효소와 MMP및 TIMP에 의해 일정하게 유지된다. 그러나 피부 내 콜라겐의 합성 저하나 MMP1의 과도 작용, TIMP 감소 등으로 인해 균형이 깨져서 피부의 콜라겐이 감소될 때 피부탄력이 없어지고 주름이 발생한다. 이는 자연의 노화 현상이며, 아울러 자외선이나 염증, 슈퍼옥시드기 (superixide) 등의 나쁜 인자도 MMP1을 촉진하고, 그 결과 피부노화를 앞당기며 주름을 악화시킨다. 진피의 기질은 점단백다당 (mucoplysaccharide)인 glycosaminoglycan으로 이루어져 있으며, 그 주성분은 히라루론산 (hyaluronic acid)와 콘드로이틴 설페이트 (chorndrotin sulfate)이고, 일부 헤파란설페이트 (heparan sulfate)도 포함되어 있다. 이들은 매우 강력한 수분 보존기능을 가진다. 피부에는 여러가지 유형의 히라루론산 합성효소 (hyaluronan synthase, HAS)가 존재하며, 그 중 표피 각질세포에는 제 3형의 HAS가, 그리고 진피 섬유모세포에는 2형의 HAS가 존재한다. 최근 피부에 물경로 단백 (water channel protein)인 aquaporin(AQP)의 3번 째 형 (AQP3)이 발현됨이 발견되었으며, 이들이 피부 수분조절에 중요한 역할을 가능성도 제기되고 있다. 피하조직은 피하지방층이라고 하며 지방조직으로 되어 있으며, 표피 및 진피로의 영양공급, 체형결정, 체온유지 등의 역할을 맡고 있으며 몸의 열 절연체로써 작용한다. 진피 밑에 있으며 혈관, 림프관, 신경, 지방세포로 구성되며 압박에 잘 견딜 수 있도록 쿠션 역할을 한다. 인체 피부의 유형은 피지와 수분의 함유량에 따라 (1) 정상형, (2) 지성(oily type), (3) 건성 (dry skin), (4) 혼합형 (mixed type)의 4가지로 분류되는 것이 보통이다. 여기에 5번째로 민감성(sensitive) 피부가 추가되는 추세이며, 노화의 정도를 추가로 평가한다. 그러나 연령과 성별, 호르몬 상태, 영양상태, 생활 습관, 환경 등의 다양한 요소에 의해 영향을 받으므로 피부의 유형은 항상 변할 수 있다. 이러한 피부 유형의 분류는 적절한 피부 관리와 화장품의 선택에 있어서 매우 중요하다. 피부와 관련하여 가장 중요한 것 중 하나가 피부 미용과 화장품이다. 화장품 (cosmetics)의 정의는 국가 별로 다소 차이가 있으나 국내나 일본의 경우 인체를 청결 또는 미화하고 피부 또는 모발을 건강하게 유지하기 위해서 도찰, 살포, 기타 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 가리킨다. 이에 대해 미국의 경우 인체의 구조, 기능의 변화 없이 청결 또는 아름답게 하고 매력을 촉진하여 외모를 변형시키기 위해 인체에 적용되는 물품을 가리키고, 유럽의 경우 치아나 구강점막도 그 영역에 포함시키고 있다. 이에 대해 약리적인 영향을 나타내거나 인체의 구조, 기능에 변화를 주는 것은 약물로 분류가 된다. 다만 최근에는 이 양자 사이에 어디에 속하는 화장품으로서 인체 피부의 구조나 기능에 영향을 미치는 것들이 다수 나오고 있는 바 이들을 미용약품 (cosmecuticals)이라고 한다 (안 성구, 이 승현. 피부미학. 고려의학. 2002년; Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005). 화장품은 기본적으로 안정적이어야 하고, 안전해야 하며, 유용해야 하고 사용성이 뛰어나야 하는 4가지 조건을 가진다. 여기에서 유용성은 물리화학과 생리, 심리학적 측면에서 효과를 가리키며, 예컨대 보습, 주름방지, 노화억제, 미백, 유연, 색체, 청결 효과를 가리킨다. 개인마다 피부의 형과 상태는 모두 틀리므로 개인 별로 적합한 화장품을 선택하는 것이 중요하다. 아울러 사용 전후에 비교하여 그 효과를 정확하고 객관적으로 평가할 수 있는 기준을 세우는 것이 중요하다 (안 성구, 이 승현. 피부미학. 고려의학. 2002년). 인체 피부의 상태를 평가하며, 화장품이나 미용약품을 투여한 후 그 효과를 판정하는 데 도움이 되는 검사로는 크게 (1) 형태학적 검사법 (imaging study)들과 (2) 피부의 색을 분석하는 방법들, (3) 피부의 단단함과 탄력성을 검사하는 방법들, (4) 피부 온도 및 혈류 검사법들, (5) 표피를 통한 수분소실(transepidermal water loss, TEWL)의 정도를 검사하는 방법들, (6) 피부 보습(hydration) 정도를 검사하는 방법들, (7) 지질성분조성 평가방법, (8) 자외선차단효과 측정법들, (9) 모발의 수분, 손상 평가 방법들, (10) 초음파 등의 7가지 종류가 있다 (안 성구, 이 승현. 피부미학. 고려의학. 2002년; Grove GL et al. Evaluating cosmeceutical efficiency. In: Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005). 그러나 이들 대부분의 검사는 피부의 구조나 형태, 기능, 생리 및 병리의 어느 한가지 부분들만 집중적으로 조사하므로 주관적이어서 객관적이지 못하며, 재현성이 부족하여 실제 응용에 한계가 있다. 따라서 인체 피부의 상태를 정확하고 객관적으로 평가하며, 분류에 도움이 되고, 개인별로 적절한 화장품이나 미용약물을 맞춤식으로 선택하고, 투여 후 그 효과를 판정하는 데 도움이 되는 새로운 검사가 필요하다. 본 발명의 한 목적도 여기에 있다. 오늘날 화장품은 인체를 아름답게 하고 청결하게 하며 피부나 모발을 건강하게 유지하기 위한 기존의 화장품의 개념에서 나아가 이제는 적극적으로 피부를 변화, 개선시킬 수 있는 기능성 화장품으로 바뀌고 있으며, 화장품과 약물의 기능을 혼용하는 미용약물 (cosmeceuticals)이 주류가 되어가는 경향이다. 화장품산업은 화학과 생물학, 약학, 피부과학의 기초기술과 응용기술이 복합되는 종합산업이다. 여기에 최근에는 분자유전학이 도입되어 피부의 생리활성과 분자병리를 더 정확하게 이해하며, 개개인의 피부에 맞는 맞춤식의 피부관리와 화장품, 미용약물을 개발하려는 시도가 이루어 지고 있다. 피부에는 다양한 질환이 발생하며, 다양한 증상 (symptom)과 징후 (sign)를 나타낸다. 피부에 나타나는 질환으로는 유전성질환, 신경피부질환, 광손상, 물리적 인자에 의한 피부질환, 직업성 피부질환, 두드러기 (urticaria )와 홍반(erythema) 및 약진 (drug erution), 습진 (eczema), 건선 (psoriasis), 면역이상 질환, 감염, 성인성질환 (sexually transmitted diseases), 색소이상증, 혈관질환, 결합조직질환 (connective tissue disorders), 피하지방질환, 피지선 및 한선의 질환, 모발질환, 조갑 (nail)의 질환, 양성 및 악성종양과 전암병변 (precancerous lesion), 점막질환 등이 있으며, 내분비질환이나 대사 이상 등 전신질환에 의해 피부질환이 나타나는 경우도 적지 않다. 감염도 원인균이 박테리아, 결핵균, 진균 (fungus), 바이러스, 기생충 등 다양하며, 성감염도 중요한 피부질환이다. 피부에 나타나는 증상으로는 소양감 (itching, pruritus)과 작열감, 얼얼힌 감각, 동통, 지각감퇴, 무감각증 등이 있다. 피부의 징후에는 크게 초기 병변인 원발진 (primary lesion)과 원발진이 진행되어서 오는 속발진 (secondary lesion)이 있다. 원발진에는 반점 (macule), 반 (patch), 구진 (papule), 판 (plaque), 결절 (nodule), 종양 (tumor), 팽진, 소수포 (vesicle) 등이 있으며, 속발진으로는 인설 (scale). 가피 (crust), 찰상 (excoriation), 미란 (erosion), 궤양 (ulcer), 반흔 (scar), 균열 (fissure), 태선화 (Lichenification)이 있다. 피부는 직접 들여다 볼 수 있어서 진단이 쉬울 것으로 보인다. 그러나 피부에 발생하는 다양한 질환은 서로 유사한 증상과 징후를 보일 수 있으며, 동일한 환자에서 동일한 질환도 시기에 따라 변화하여 다른 양상을 보일 수 있다. 따라서 주관적 증상의 문진이나 징후의 이학적 검사만으로는 진단이 어려운 경우가 많고, 전문의들의 경우에도 감별진단에 어려움을 겪는 경우가 많다. 피부질환 진단을 위한 검사로는 피부 세균 감염의 검사인 그람염색과 배양검사, 진균 감염에 대한 검사인 KOH 염색과 배양, 단숨 및 대상 포진(herpes simplex and herpes zoster)의 검사인 쟁크검사 (Tzanck test), 옴의 검사인 옴소파 (Scabies scraping), 매독 (syphilis)에 대한 암시야검사 (dark field examination), 첩포시험 (patch test), 피부를 주사 (injection)나 단자 (prick), 소파 (scratch) 등으로 자극하여 반응을 보는 검사, 피부묘기증 (dermographism), 압시경 검사 (diascopicexamination), 우드경 검사 (Wood lamp examination) 등이 있다. 이상의 검사로 진단이 내려 지지 않을 때에는 피부 생검 (biopsy), 즉 조직검사를 한 후 염색하에 광학현미경으로 보거나, 면역조직화학염색 (immunohistochemical staining) 으로 보는 방법, 면역형광검사 (immunofluorescence test), 전자현미경으로 관찰하는 방법이 사용된다 (안 성구, 이 승헌. 피부미학. 고려의학. 2002년.; 대한피부과학 교과서 펀찬위원회 편저. 피부과학. 개정 4판. 여문각. 2001년). 그러나 이상의 모든 검사는 피부 병변의 형태를 미시적으로 보는 검사일 뿐, 그 생리적 변화나 기능적 변화, 생화학적 변화, 분자적 변화, 유전자적 변화는 보지 못한다는 단점이 있고, 따라서 그 정확도와 유용성에는 한계가 있다. 따라서 피부 질환이 있을 때 이의 근본적 원인과 변화를 파악하고, 각각에 따라 최적의 맞춤식 치료법을 결정할 수 있는 새로운 검사법이 절실한 상황이다. 피부의 상태와 유형은 그 피부에서 발현되는 유전자와, 이에 따라 만들어지는 단백, 탄수화물, 지질 등의 구성요소의 변화, 구성 세포의 상태에 따라 결정되며, 여기에는 타고난 유전적 소양과 후천적 요인, 예컨대 환경적 요인과 식사, 생활 습관 등이 함께 작용하여 나타난다. 따라서 피부의 타고난 유전적 소인을 검사하고, 나아가 피부에서 발현되는 유전자를 조사하면 그 피부의 상태를 가장 정확하고 근본적으로 검사할 수 있을 것이다. 본 발명의 주제도 여기에 있다.