항-ＶＥＧＦ 항체 document_id A220623041491

혈관신생 및 VEGF 혈관신생은 혈관 내피세포가 증식하고, 잘라내고 재구성되어 기존재하는 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 중요한 세포 현상이다. 혈관 공급의 발달은 정상 및 병리적 증식 과정에 필수적이라는 주목하지 않을 수 없는 증거가 존재한다 (Folkman and Klagsbrun (1987) Science 235: 442-447). 산소 및 영양분의 전달 및 이화 산물의 제거는 다세포 기관에서 발생하는 성장 과정의 대부분에서 속도 제한 단계를 나타낸다. 따라서, 충분하지는 않지만 혈관 구획이 배형성 동안의 기관 발생 및 분화 뿐만 아니라 성인에서 상처 치료 및 생식 기능에 필요하다고 일반적으로 가정되어 왔다. 혈관신생은 또한 증식성 망막병증, 노화성 황반변성, 종양, 류마티스성 관절염 (RA) 및 건선을 포함하여 이로 제한되지 않는 다양한 질환의 발병에 관련된다. 혈관신생은 1) 프로테아제 방출 후에 국소 발생지의 세포외 매트릭스의 분해, 2) 모세 내피세포의 증식, 및 3) 혈관신생 자극을 향한 모세 세관의 이동으로 이루어지는 일련의 과정이다 (Ferrara et al. (1992) Endocrine Rev. 13: 18-32). 혈관신생의 현저한 생리학적 및 병리적 중요성의 측면에서, 상기 과정을 조절할 수 있는 인자의 규명에 대한 많은 연구가 수행되었다. 혈관신생 과정은 혈관신생성 분자 및 항혈관신생성 분자 사이의 균형에 의해 조절되고 다양한 질병, 특히 암에서 손상된다고 제안된다 (Carmeliet and Jain (2000) Nature 407: 249-257). 혈관 내피세포의 효능있는 미토겐인 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF)는 정상적 및 비정상적 혈관신생의 중추적인 조절인자로 보고되었다 (Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543). 혈관 형성 과정에 기여하는 다른 성장 인자에 비해, VEGF는 혈관계 내의 내피세포에 대한 높은 특이성에서 특유하다. 최근의 증거는 VEGF가 배아 혈관형성 및 혈관신생에 필수적임을 나타낸다 (Carmeliet et al. (1996) Nature 380: 435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380: 439-442). 또한, VEGF는 여성 생식로에서의 주기적인 혈관 증식에, 골 성장 및 연골 형성에 필요하다 (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4: 336- 340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5: 623-628). 혈관신생 및 혈관형성에서 혈관신생 인자인 것 이외에, 다면 성장 인자로서 VEGF는 다른 생리학적 과정, 예를 들어 내피세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관확장, 단핵구 화학주성 및 칼슘 유입에서 다중의 생물학적 효과를 보인다 (Ferrara and Davis-Smyth (1997), 상기 문헌). 또한, 최근 연구는 일부 비-내피세포 타입, 예를 들어 망막 색소 상피세포, 췌장 도관 세포 및 쉬반 (Schwann) 세포에 대한 VEGF의 미토겐 활성을 보고하였다 (Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164 : 385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126: 125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19: 5731-5740). 또한, 실질적인 증가는 병리적 혈관신생을 수반하는 상태 또는 질병의 발생시에 VEGF의 중요한 역할을 제시한다. VEGF mRNA는 조사된 대부분의 인간 종양에 의해 과다발현된다 (Berkman et al. J Clin Invest 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer. 73: 931-934 (1996); 및 Dvorak et al., Ain J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995)). 또한, 안액 내의 VEGF의 농도는 당뇨 및 다른 허혈 관련 망막병증 환자의 혈관의 활발한 증식의 존재에 매우 밀접한 관련이 있다 (Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994)). 또한, 최근의 연구는 AMD 이환 환자의 맥락막 신생혈관 막 내의 VEGF의 편재를 보여주었다 (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37: 855-868 (1996)). 병리적 상태에서 혈관신생의 1차 조절자로서 VEGF를 인식함으로써 VEGF 활성을 차단하기 위한 많은 시도가 실시되었다. 억제성 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 수용체 구조체, 안티센스 전략, VEGF에 대한 RNA 앱타머 및 저분자량 VEGF 수용체 타이로신 키나제 (RTK) 억제제 모두가 VEGF 시그날링 방해에 사용하기 위해 제안되었다 (Siemeister et al. Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248 (1998)). 실제로, 항-VEGF 중화 항체는 누드마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌고 (Kim et al., Nature 362: 841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996); 및 Melnyk et al. Cancer Res. 56: 921-924 (1996)), 또한 허혈성 망막 질환 모델에서 안내 혈관신생을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114: 66-71 (1996)). 따라서, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 다른 VEGF 활성 억제제는 고형 종양 및 다양한 안내 신생혈관 질환의 치료를 위한 유망한 후보물질이다. VEGF 분자는 종양 세포에서 상향조절되고 그의 수용체는 종양 침윤 혈관 내피세포에서 상향조절되지만, VEGF 및 그의 수용체의 발현은 혈관신생에 관련되지 않은 정상 세포에서 낮게 유지된다. 치료 항체 모노클로날 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체, 특히 설치류로부터 유래한 항체가 널리 사용되고 있지만, 비인간 항체는 인간에서 자주 항원성이다. 당업계는 비인간 항원 결합 도메인이 인간 불변 도메인에 커플링된 "키메릭 (chimeric)" 항체를 제조함으로써 상기 문제를 극복하고자 시도하였다 (카빌리 (Cabilly) 등의 미국 특허 4,816,567). 인간 불변 도메인의 아이소타입은 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 및 보체 의존적 세포독성에 참여하기 위해 키메릭 항체를 테일러링하도록 선택할 수 있다. 항체의 항원 결합 기능을 해결하고 인간 항체의 이종 서열 사용을 최소화하기 위한 추가의 노력에서, 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비인간종의 대응하는 서열에 의해 영역에서 치환된 다양한 항원에 대한 인간화 항체가 생성되었다. 예를 들어, 설치류 (CDR) 잔기가 인간 항체의 대응하는 세그먼트 대신에 사용되었다. 실제로, 인간화 항체는 일부 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다 (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)). 복수의 인간화 항-인간 VEGF 항체가 성공적으로 개발되었고, 시험관내 및 생체내 모두에서 충분한 huVEGF-억제 활성을 보였다 (Presta et al. (1997) Cancer Research 57: 4593-4599; Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881). 한 특정 인간화 항-VEGF 항체, Avastin(등록상표) 항체는 상이한 고형 종양 치료를 위한 복수의 임상 시험에 현재 사용되고 있고, 인간화 항-VEGF 항체의 다른 고친화도 변이체가 현재 맥락막 혈관신생 관련 노화 황반변성 (AMD) 치료를 위해 임상적으로 시험되고 있다. 치료 항체를 인간에 투여하기 전에, 항체의 효능 및(또는) 독성을 평가하기 위해 비인간 포유동물에서의 전임상 연구가 일반적으로 필요하다. 이상적으로는, 상기 연구에 적용되는 항체는 숙주 동물, 예를 들어 마우스 또는 비인간 영장류에 내인성인 표적 항원을 인식하여 고효능으로 반응할 수 있다. 파지 디스플레이 파지 디스플레이 기술은 리간드, 예를 들어 항원에 결합하는 신규 단백질 생성 및 선택을 위한 유용한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시켜 고친화도를 갖는 표적 항원에 결합하는 서열에 대해 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 바이러스 코트 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 융합된다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열에 융합된 일가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다 (Bass, S., Protein, 8: 309 (1990); Lowman and Wells, Method: A Companion to Method Enzymology, 3: 205 (1991)). 일가 파지 디스플레이 시스템에서, 유전자 융합은 저수준에서 발현되고, 야생형 유전자 III 단백질도 발현되어 입자의 감염성이 유지된다. 펩티드 라이브러리의 생성 및 상기 라이브러리의 스크리닝 방법은 많은 특허(예를 들어, 미국 특허 5,723,286, 미국 특허 5,432,018, 미국 특허 5,580,717, 미국 특허 5,427,908 및 미국 특허 5,498,530)에 개시되어 있다. 이. 콜라이 (E. coli)의 주변세포질에서 필라멘트성 파지의 표면 상의 펩티드의 발현 및 기능성 항체 단편의 발현의 입증은 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 개발에 중요하였다 (Smith et al., Science (1985), 228: 1315; Skerra and Pluckthun, Science (1988), 240: 1038). 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리는 랜덤 DNA 서열의 삽입에 의해 또는 일군의 관련 유전자의 클로닝에 의해 단일 유전자를 변경시키는 것을 포함하여 많은 방법으로 제조되었다. 파지 디스플레이를 사용하여 항체 또는 항원 결합 단편을 디스플레이하는 방법은 미국 특허 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717 및 5,658,727에 기재되어 있다. 이어서, 라이브러리는 요구되는 특성을 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현에 대해 스크리닝된다. 파지 디스플레이 기술은 통상적인 하이브리도마 및 요구되는 특성을 갖는 항체의 재조합 제조 방법에 대해 몇가지의 잇점을 갖는다. 상기 기술을 통해 더 단시간 내에 동물을 사용하지 않으면서 큰 항체 라이브러리를 개발할 수 있다. 하이브리도마의 제조 또는 인간화 항체의 제조는 수개월의 제조 기간이 소요될 수 있다. 또한, 면역처리가 필요하지 않기 때문에, 독성이거나 낮은 항원성을 갖는 항원에 대한 파지 항체 라이브러리를 제조할 수 있다 (Hogenboom, Immunotechnologies (1988), 4: 1-20). 파지 항체 라이브러리는 또한 신규한 치료 항체의 제조 및 확인에 사용될 수도 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 면역화, 비면역화 인간, 생식선 서열 또는 나이브 (naive) B 세포 Ig 레퍼토리로부터 인간 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다 (Barbas 0026# Burton, Trends Biotech (1996), 14: 230; Griffiths et al., EMBO J. (1994), 13: 3245; Vaughan et al., Nat. Biotech. (1996), 14: 309; Winter EP 0368 684 B 1). 나이브, 또는 비면역 항원 결합 라이브러리는 다양한 임파구양 조직을 사용하여 생성시켜왔다. 상기 라이브러리의 일부는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어 문헌 [Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan et al. (1996) Nature Biotech 14: 309; Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296: 57]에 의해 개발된 라이브러리). 그러나, 상기 많은 라이브러리는 그 다양성이 제한되었다. 파지 디스플레이로부터 고친화도 항체를 확인 및 단리하는 능력은 치료용의 신규한 항체 단리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화도 항체의 단리는 라이브러리의 크기, 세균 세포에서 제조 효능 및 라이브러리의 다양성에 의존한다 (예를 들어, Knappik et al., J. Mol. Biol. (1999), 296: 57 참조). 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합 단백질의 부적절한 폴딩 및 정지 코돈의 존재 때문에 제조 효능에 의해 감소된다. 세균 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합 도메인이 부적절하게 폴딩될 경우 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면에서 또는 선택된 CDR 잔기에서 잔기를 차례로 변이시켜 개선시킬 수 있다 (Deng et al., J. Biol. Chem. (1994), 269: 9533, Ulrich et al., PNAS (1995), 92: 11907-11911; Forsberg et al., J. Biol. Chem. (1997), 272: 12430). 프레임워크 영역의 서열은 항체 파지 라이브러리가 세균 세포에서 생성될 때 적절한 폴딩 제공시의 작용 인자이다. 또한, 항체 또는 항원 결합 단백질의 다양한 라이브러리의 생성은 고친화도 항체 단리에 중요하다. 제한된 CDR의 다양성을 갖는 라이브러리는 다양한 방법을 사용하여 생성시켜왔다 (예를 들어, Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18: 989-994 참조). CDR3 영역은 항원 결합에 참여하는 것으로 종종 밝혀졌기 때문에 부분적으로 관심의 대상이다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 형태에서 크게 상이하다. 또한, 다른 연구자들은 각각의 위치에서 모든 20개의 아미노산을 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 랜덤화하여 다양성을 생성시켰다. 모든 20개의 아미노산의 사용은 변이체 항체 서열의 큰 다양성을 생성시키고 신규 항체를 확인할 가능성을 증가시킨 것으로 생각된다 (Barbas, PNAS 91: 3809 (1994); Yelton, DE, J. Immunology 155: 1994 (1995); Jackson, J.R., J. Immunology 154: 3310 (1995) 및 Hawkins, RE, J. Mol. Biology, 226: 889 (1992)). 또한, 천연 항체에서 아미노산 분포를 반영하기 위해 일부 CDR에서 아미노산 치환을 제한함으로써 다양성을 생성시키려는 시도가 있었다 (Garrard 0026# Henner, Gene (1993), 128: 103; Knappik et al., J. Mol. Biol. (1999) 296 : 57 참조). 그러나, 이러한 시도는 그 성공이 변동적이고, 시스템 및 정량적 방법으로 적용되지 않았다. 아미노산 변경을 최소화하면서 CDR 영역의 다양성 생성이 연구 대상이 되었다. 003c#발명의 개요003e# 본 발명은 신규한 항체 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 각 수치의 10배 이내의 Kd값으로 설치류 VEGF 및 인간 VEGF에 결합할 수 있는, VEGF의 VEGF 수용체 결합을 억제할 수 있는 항체를 제공하는 것이다. 한 실시태양에 따르면, 항체는 비돌연변이된 인간 VEGF의 Kd값의 10배 이내의 Kd값으로 Gly88Ala (G88A) 또는 Gly88Ser (G88S) 인간 VEGF 돌연변이체 중의 하나 또는 둘 모두에 결합할 수 있다. 본 발명은 25℃에서 10 nM 이하의 Kd값으로 인간 VEGF 및 마우스 VEGF에 결합할 수 있고 VEGF의 VEGF 수용체에 대한 결합을 억제할 수 있는 항체를 제공한다. 다른 실시태양에 따르면, Kd값은 2 nM 이하이다. 다른 실시태양에 따르면, Kd값은 0.1 nM 이하이다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 약 1 nM 이하, 또는 약 500 pM 이하의 Kd값으로 VEGF에 결합한다. 또한, 본 발명은 인간 VEGF 및 인간 VEGF의 G88A 및 G88S 돌연변이체의 하나 또는 둘 모두에 10 nM 이하의 Kd값으로 결합할 수 있는, VEGF의 VEGF 수용체에 대한 결합을 억제할 수 있는 항체를 제공한다. 다른 실시태양에서, 항체는 인간 VEGF 및 인간 VEGF G88A 및 G88S 돌연변이체의 하나 또는 둘 모두에 10 nM 이하의 Kd값으로 결합한다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체의 인간 및(또는) 마우스 VEGF에 결합하기 위한 온-레이트 (on-rate) (kon)는 1.0 이상 (10M-1S-1)이다. 다른 실시태양에 따르면, 온-레이트는 5.0 이상 (10M-1S-1)이다. 또다른 실시태양에 따르면, 온-레이트는 10.0 이상 (10M-1S-1)이다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 G88의 총 표면적 (Å2)의 80% 미만과 접촉한다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 G88의 총 표면적 (Å2)의 70% 미만과 접촉한다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 G88의 총 표면적 (Å2)의 60% 미만과 접촉한다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 G88의 총 표면적 (Å2)의 1% 미만과 접촉한다. 상기 항체는 일반적으로 마우스 VEGF에도 결합할 수 있다. VEGF에 대한 결합이 억제되는 VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1 (Flt-1), VEGF 수용체 2 (KDR) 또는 두 수용체 모두일 수 있다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 VEGF의 20s 헬릭스와 접촉한다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 VEGF의 80s 루프와 접촉한다. 본 발명의 또다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 20s 헬릭스 및 80s 루프와 접촉한다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 잔기 F17, M18, Q22, Y25, D63, L66, C104 및 P106의 어느 하나에 대한 상대 친화도를 갖거나 상기 어느 한 잔기에 접촉할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 잔기 F17, M18, Q22, Y25, D63, L66, C104 및 P106에 대한 상대 친화도를 갖거나 상기 잔기에 접촉할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 잔기 F17 및 Y21에 대한 상대 친화도를 갖거나 상기 잔기에 접촉할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 VEGF의 잔기 Y25에 대한 추가의 상대 친화도를 갖거나 상기 잔기에 접촉할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 잔기 M18 및 Q89에 대한 상대 친화도를 갖거나 상기 잔기에 접촉할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 VEGF의 잔기 M18, Y21 및 Y25에 대한 상대 친화도를 갖거나 상기 잔기에 접촉할 수 있다. 바람직한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 상기 언급한 실시태양의 3 이상의 조합을 가질 수 있다. 추가 실시태양에서, 발명의 항체는 본원에서 설명하는 기능적 에피토프를 갖는다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명에 따른 항체의 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17을 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명에 따른 항체의 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17 및 I83을 포함한다. 또다른 실시태양에 따르면, 항체의 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, I83 및 Q89를 포함한다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명에 따른 항체의 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17 및 M18을 포함한다. 추가 실시태양에서, 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, M18 및 I89를 포함한다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명에 따른 항체의 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, Y21 및 Y25를 포함한다. 또다른 실시태양에 따르면, 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63 및 I83을 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, Y21, Y25 및 Q89를 포함한다. 또다른 실시태양에 따르면, 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 및 C104를 포함한다. 또다른 실시태양에 따르면, 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함한다. 본 발명에 따른 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 F17, M18, Y21, Q22, Y25, K48, D63, L66, M81, I83, H86, Q89, I91, C104 및 P106으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 임의의 잔기의 조합을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 기능적 에피토프는 인간 VEGF의 잔기 F17, M18, Y21, Q22, Y25, K48, D63, L66, M81, I83, H86, Q89, I91, C104 및 P106을 포함한다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 인접하는 아미노산 서열 X1X2FX4X5X6X7을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 상기 서열에서, X1은 Y 또는 F이고; X2는 V 또는 A이고; X4는 F 또는 Y이고; X5는 L 또는 A이고; X6은 P 또는 A이고; X7은 Y 또는 F이다. 다른 실시태양에 따르면, 항체는 인접하는 아미노산 서열 GX2TPX5G (서열 1)을 추가로 포함한다. 상기 서열에서, X2는 I 또는 V이거나 다른 소수성 아미노산이고, X5는 임의의 아미노산 잔기이다. 또다른 실시태양에 따르면, 항체는 또한 인접하는 아미노산 서열 X1X2X3zIH (서열 2)을 갖는 CDR-H1을 추가로 포함한다. 상기 서열에서, X1은 임의의 아미노산 잔기이고; X2는 Y 또는 F이고; X3은 W 또는 L이다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 항체는 도 7의 항체 중의 임의의 하나의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, CDR-L1은 대략 잔기 28-33에 위치하고, CDR-L2는 대략 잔기 50-55에 위치하고; CDR-L3은 대략 잔기 91-96에 위치한다. 다른 실시태양에 따르면, CDR-H1은 대략 잔기 30-33에 위치하고, CDR-H2은 대략 잔기 50-58에 위치하고; CDR-L3은 대략 잔기 94-100a에 위치한다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 항체는 G6 항체, G6-23 항체 또는 G6-31 항체의 프레임워크 영역을 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, 항체는 G6 항체, G6-23 항체 또는 G6-31 항체의 경쇄 CDR 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 (a) 인접하는 아미노산 서열 X1X2X3X4X5L (여기서 X1 및 X2는 임의의 아미노산이고; X3 또는 X4 또는 둘 모두는 R이고; X5는 S 또는 A이다)(서열 916)을 포함하는 CDR-L1 ; (b) 인접하는 아미노산 서열 X1X2X3 (여기서 X1은 S 또는 A 또는 G이고; X2 및 X3은 임의의 아미노산 잔기이다)(서열 917)을 포함하는 CDR-L2 ; 및 (c) 인접하는 아미노산 서열 SX1X2X3PL (여기서 X1 및 X2는 임의의 아미노산 잔기이고; X3은 S 또는 A이다)(서열 918)을 포함하는 CDR-L3 를 포함하는 항체이다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 항체는 B20-4.1 항체 또는 B20-4 항체의 프레임워크 영역을 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, 항체는 B20 중쇄 가변 영역의 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, CDR-L2의 X1X2X3 (서열 917)은 X1ASX4LX6 (서열 919) (여기서, X4 및 X6은 임의의 아미노산임)에 의해 코딩된다. 다른 실시태양에 따르면, CDR-L1은 대략 잔기 28-33에 위치하고, CDR-L2은 대략 잔기 50-55에 위치하고; CDR-L3은 대략 잔기 91-96에 위치한다. 다른 실시태양에 따르면, CDR-H1은 대략 잔기 30-33에 위치하고, CDR-H2은 대략 잔기 50-58에 위치하고; CDR-L3은 대략 잔기 94-100a에 위치한다. 또한, 도 2, 7, 24-29 및 34-43의 항체의 어느 하나의 CDR-H3 서열을 포함하고, 임의로 도 2, 7, 24-29 및 34-43의 동일한 항체의 CDR-H2 및(또는) CDR-H1을 추가로 포함하는 항체가 본 발명에 포함된다. 또한, G6 계열 항체, B20 계열 항체, YADS 계열 항체 및 YS 계열 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 항체가 본 발명에 포함된다. 또한, 추가의 본 발명의 항체는 도 2, 7, 24-29 및 34-43의 항체 중의 어느 하나의 가변 영역을 포함하는 항체이다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 하이브리도마로부터 직접 생성되거나 또는 하이브리도마로부터의 항체 서열로부터 유래되기보다는 재조합 방법으로 합성된다. 한 바람직한 실시태양에서, 항체는 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 500 pM 이하의 10 nM 이하의 Kd값으로 hVEGF에 결합한다. 한 실시태양에 따르면, 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 실시태양에 따르면, 항체는 다중 특이적 (multi-specific) 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 고친화도 항-hVEGF 항체는 또한 그의 hVEGF 결합을 위한 Kd값에 대등하거나 또는 적어도 10배 이내의 Kd값으로 비인간 포유동물 종으로부터의 VEGF에 결합할 수 있다. 종간 높은 결합 친화도를 갖는 상기 항체는 특히 진단 및 치료 용도 뿐만 아니라 전임상 연구에도 유용하다. 치료용 항체의 일부는 면역원으로서 표적 인간 항원을 사용하여 생성시켰다. 생성되는 항체는 "종 의존성"일 수 있다. 즉, 인간 항원에 특이적으로 결합하면서 비인간 포유동물로부터의 항원의 상동체에 결합시에 훨씬 덜 효과적일 수 있다. 이것은 본원에서 특히 비인간 포유동물이 항체의 전임상 연구가 수행되는 대상인 경우에 문제가 됨이 밝혀졌다. 그 일례는 암 치료에 사용되는 항-VEGF 항체, Avastin(등록상표) 항체이다. Avastin(등록상표) 항체는 인간 VEGF에 대해 강한 결합 친화도를 갖지만 (즉, Kd=1.8 nM), 쥐 VEGF에 대한 친화도는 마우스 모델에서 실험을 수행하기에 부적합하였다. 한 특징에서, 항체는 그의 가변 도메인에 적어도 하나의 변이체 CDR을 포함하는 합성 항체로서, 상기 변이체 CDR은 하나 이상의 용매 접근가능하고 매우 다양한 아미노산 위치에 변이체 아미노산을 포함하고, 변이체 아미노산은 비랜덤 코돈 세트에 의해 코딩되고, 비랜덤 세트에 의해 코딩되는 아미노산의 적어도 70%는 공지의 항체 가변 도메인 내의 위치에 대한 표적 아미노산이다. 항체는 CDR Hl, H2 및 H3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 변이체 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 가질 수 있다. 바람직하게는, 중쇄 가변 도메인은 변이체 CDR H3을 포함한다. 또한, 항체는 CDR L1, L2 및 L3으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 1, 2 또는 3개의 변이체 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 가질 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 요구되는 친화도를 갖는 인간 VEGF 및 설치류 VEGF에 결합하지만, 인간 VEGF-B, 인간 VEGF-D 및 인간 P1GF-2로 이루어지는 군 중에서 선택되는 VEGF-관련 상동체의 어느 하나 또는 모두에 결합하지 않는다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 상기 언급한 실시태양의 어느 하나의 3 이상의 조합을 갖는다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 Fab 항체는 Fab 항체의 반감기를 증가시키는 물질에 컨쥬게이팅된다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 상기 물질은 서열 DICLPRWGCLW를 포함하는 폴리펩티드이다. 한 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 P1GF, VEGF-D 또는 VEGF-B에 결합하지 않는다. 또한, 본 발명은 a) 적어도 하나의 CDR에 고안된 다양성을 갖는 합성 항체의 라이브러리를 생성시키는 단계; b) 라이브러리를 hVEGF와 접촉시켜 바인더를 형성하는 단계; c) 비-바인더로부터 바인더를 분리하고, 표적 hVEGF로부터 바인더를 용출시켜 약 0.1 nM 내지 1000 nM 농도로 표적 hVEGF의 양을 감소시키면서 용액에서 바인더를 인큐베이션하는 단계 및 d) 표적 VEGF의 가장 낮은 농도에서 결합할 수 있고 친화도가 약 500 pM 내지 2 nM인 바인더를 선택하는 단계를 포함하는, 합성 항체의 라이브러리로부터 hVEGF 항체를 선택하는 방법을 제공한다. 또한, hVEGF 또는 비인간종의 VEGF 또는 둘 모두에 대한 결합 친화도가 개선된 합성 항체의 변이체도 본 발명에 포함된다. 항체 및 그의 변이체의 다양한 형태가 본원에 개시된다. 예를 들어, 항체 돌연변이체는 전장 (full length) 항체 (예를 들어 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는) 또는 항체 단편 (예를 들어 Fab 또는 F(ab')2)일 수 있다. 또한, 항체 돌연변이체는 검출가능한 표지로 표지되고, 고상에 고정 및(또는) 이종 화합물 (예를 들어 세포독성제)에 컨쥬게이팅될 수 있다. 항체의 진단 및 치료 용도도 포함된다. 한 진단 용도에서, 본 발명은 단백질을 포함하는 것으로 의심되는 시료를 항체 돌연변이체에 노출시키는 단계 및 항체 돌연변이체의 시료에 대한 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 이 용도를 위해, 본 발명은 항체 돌연변이체 및 단백질을 검출하기 위해 항체 돌연변이체를 사용하기 위한 지시서를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 항체를 코딩하는 단리된 핵산; 임의로 벡터로 형질전환된 숙주에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 벡터; 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 임의로 숙주 세포 배양액으로부터 (예를 들어 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체 돌연변이체를 회수하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법을 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 치료용 조성물은 멸균되고 동결건조될 수 있다. 또한, 본원에서 설명되는 증상의 치료용 의약 제조시의 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 용도도 포함된다. 상기 조성물은 제2 치료제, 예를 들어 화학요법제, 세포독성제 또는 항혈관형성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 유효량의 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 치료 방법을 추가로 제공한다. 본 방법에서 치료할 포유동물은 비인간 포유동물, 예를 들어 임상 데이타 수집에 적합한 영장류 또는 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트 또는 토끼)일 수 있다. 비인간 포유동물은 건강할 수 있거나 (예를 들어, 독성학 연구에서) 또는 목적하는 항체로 치료되는 질환이 있을 수 있다. 한 실시태양에서, 포유동물은 비정상적 혈관신생 (예를 들어, 병리적 혈관신생)으로 고통받거나 발생할 위험이 있다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 질환은 결장직장암, 신세포암, 난소암, 폐암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 세기관지폐포암 및 췌장암으로 이루어진 군 중에서 선택된 암이다. 다른 실시태양에서, 상기 질환은 안구 혈관신생에 의해 야기되는 질병, 예를 들어, 당뇨성 실명, 망막병증, 1차적 당뇨성 망막증, 노화성 황반변성 및 조홍 (rubeosis)이다. 다른 실시태양에서, 치료되는 포유동물은 부종 (예를 들어, 뇌종양과 관련된 부종, 뇌졸중과 관련된 부종, 또는 뇌부종)으로 고통받거나 발생할 위험이 있다. 다른 실시태양에서, 포유동물은 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 난치성 복수, 건선, 유육종증, 폐쇄성 동맥경화증, 패혈증, 화상 및 췌장염으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 질환 또는 병으로 고통받거나 발생할 위험이 있다. 다른 실시태양에 따르면, 포유동물은 다낭성 난소 질환 (POD), 내분열증 및 자궁 섬유종으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 비뇨생식 질병으로 고통받거나 발생할 위험이 있다. 투여되는 항체의 양은 질환 치료를 위한 치료 유효량일 것이다. 투여량 단계적 확대 연구에서, 항체의 다양한 투여량을 포유동물에 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 치료 유효량의 항체가 환자의 질환을 치료하기 위해 인간 환자에 투여된다. 한 바람직한 실시태양에서, 본원에서 설명되는 염증성 또는 면역 질병 (예를 들어, 류마티스성 관절염) 치료에 유용한 본 발명의 항체는 Fab 또는 scFv 항체, 특히 항체의 G6 계열 또는 항체의 B20 계열에서 유도된 Fab 또는 scFv 항체이다. VEGF의 응집을 야기하지 않고 그 자체, 예를 들어 IgG 항체의 B20 계열을 응집시키지 않는 항체가 염증성 및 면역 질병 치료에 특히 유용하다. 따라서, 상기 항체는 염증성 또는 면역 질병 치료용 의약 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 설명되는 질환 또는 질병으로 고통받거나 발생할 위험이 있는 포유동물은 본 발명의 항체와 동시에, 순차적으로 또는 조합하여 제2 치료제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 제2 치료제 이외의 다른 치료제가 포유동물에 투여하거나 목적하는 증상에 대한 의약 제조에 사용될 수 있다. 이들 항체 및 폴리펩티드는 이식된 비숙주 종양의 성장시에, 예를 들어 인간 종양이 이식된 마우스 모델에서 숙주 기질 세포 협조의 역할 이해에 사용될 수 있다. 상기 항체 및 폴리펩티드는 본 발명의 항-VEGF 항체로 처리한 후에 설치류 또는 토끼에 이식된 종양의 성장을 관찰 또는 모니터링함으로써 항-VEGF 치료를 회피할 수 있는 인간 종양을 확인하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 또한 발명의 항-VEGF 항체 및 다른 치료제와의 조합 요법의 연구 및 평가에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 유사한 질병으로 고생하는 동물에 항체 또는 폴리펩티드를 투여하고 질병의 하나 이상의 증상이 경감되는지를 결정함으로써 다른 질병에서 VEGF의 역할 연구에 사용될 수 있다.