신규한 브레비바실러스 초시넨시스 및 이 미생물을 숙주로 사용한 단백질 제조 방법 document_id A220623042119

유전자 재조합은 박테리아 및 동물 세포를 숙주로 사용하여, 생체에 소량으로만 존재함에따라 단리하기 어려웠기 때문에 지금까지 이용이 매우 어려웠던 단백질 및 원하는 임의의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 대량 생산을 가능하게 했다. 다양한 박테리아가 유전자 재조합을 통해 단백질 제조를 위한 숙주로 사용되며, 가장 널리 사용되는 것은 에셔리샤 콜라이 (Escherichia coli) 이다. 그러나, 에셔리샤 콜라이를 숙주로 사용한 재조합 단백질 제조 시스템에서는, 제조된 단백질이 세포 내에 축적되기 때문에, 세포 용적이 제조되는 단백질의 최대의 상한이며, 그에 따라 단백질의 대량 생산이 어렵다. 추가적으로, 다른 문제들이 존재하며, 이는 세포 내에 축적된 단백질을 수집하기 위해 에셔리샤 콜라이 세포를 파열시켜야만 하고, 파열된 에셔리샤 콜라이 내에 함유되는 세포-유래 성분, 핵산, 목적되는 것 이외의 단백질, 세포벽-유래 내독소로부터 목적되는 단백질을 단리시키고 회수하는 작업이 성가시다. 에셔리샤 콜라이 시스템의 문제를 해결하기 위해, 단백질을 분비하고 제조하는 능력을 가진 전형적인 박테리아 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 가 숙주로 사용되는 재조합 단백질 제조 시스템이 개발되었다. 바실러스 섭틸리스가 숙주로 사용되는 제조 시스템에서는, 제조된 재조합 단백질이 배지 내에서 분비되고 제조된다. 따라서, 바실러스 섭틸리스 시스템은 에셔리샤 콜라이 시스템이 갖지 않은 몇가지의 우수한 특성을 가지며, 이는 전자가 단백질 회수를 위해 세포 파열을 필요로 하지 않으며, 내독소를 거의 생성하지 않는다는 것이다. 그러나 한편, 바실러스 섭틸리스는 다량의 프로테아제를 세포외로 분비시키는 특성을 가지며, 따라서 분비되고 제조된 재조합 단백질이 프로테아제에 의해 분해되며, 재조합 단백질의 수율이 매우 낮은 심각한 문제가 존재한다. 따라서, 지금까지 바실러스 섭틸리스의 프로테아제의 제조를 감소시키기 위한 다양한 시도가 있었다. 그러나, 그럼에도 불구하고 지금까지 이종성 단백질의 공업적 제조를 위한 숙주로서 바실러스 섭틸리스로의 재조합 단백질 제조 시스템을 사용한 예가 별로 알려져 있지 않다. 한편, 바실러스 섭틸리스 시스템의 문제를 해결하기 위해, 세포외로 재조합 단백질을 분비하고 생성하지만, 세포외로 프로테아제를 분비하지는 않는 박테리아를 숙주로 사용한 새로운 재조합 단백질 제조 시스템이 개발되었다. 결과적으로, 바실러스 섭틸리스 보다 더 양호한 단백질 분비 생산성를 나타내는 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis) 47 (특허 참조문헌 1) 과 같은 바실러스 브레비스가 숙주로 사용되는 재조합 단백질 제조 시스템이 성공적으로 개발되었다. 현재, 16SrRNA 유전자의 염기 서열에 대한 그의 체계적인 분석의 결과로서, 바실러스 브레비스는 브레비바실러스 초시넨시스, 브레비바실러스 브레비스를 포함하는, 브레비바실러스 속 (genus) 의 박테리아로 재분류된다 (비-특허 참조문헌 1). 그러나, 바실러스 브레비스 47 은 약한 세포외 단백질가수분해성 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 브레비바실러스 브레비스를 숙주로 사용한 재조합 단백질 제조는 비교적 긴 시간 (일반적으로 약 3 일) 이 걸린다고 되어 있다. 따라서, 바실러스 브레비스의 세포외 단백질가수분해성 활성이 비록 약하지만, 제조된 재조합 단백질이 세포외 단백질가수분해성 활성에 의해 분해되고, 재조합 단백질의 수율이 감소하는 경우가 있을 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 지금까지 바실러스 브레비스의 세포외 단백질가수분해성 활성을 더 감소시키기 위한 다양한 시도가 있었다. 예를 들어, 바실러스 브레비스 균주는 광범위 스크리닝되었고, 매우 낮은 세포외 단백질가수분해성 활성 및 우수한 단백질 분비 생산성을 갖는 것으로서, 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31 (FERM BP-1087) (FERM BP-6863 의 균주와 동일함: 바실러스 브레비스 H102) (특허 참조문헌 2), 및 그의 돌연변이 균주, 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31-S5 (FERM BP-6623 - 이 균주는 바실러스 브레비스 HPD31-S5 의 명칭으로 수탁됨) 이 단리되었다. 이러한 균주는 인간 표피 성장 인자 (hEGF) 와 같은 다양한 재조합 단백질의 제조에서 숙주로 이용되어 왔다. 예를 들어, 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31 으로의 hEGF 의 제조는 비-특허 참조문헌 2 (여기서, 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31 은 바실러스 브레비스 HPD31 로 기술됨) 등에 나타나 있다. 그러나, 이러한 브레비바실러스 초시넨시스 HPD31 및 HPD31-S5 는 고감도 단백질가수분해성 활성 감지 방법에서 분석된 경우 세포외 단백질가수분해성 활성을 나타내었다. 예를 들어, 젤라틴-PAGE (자이모그래프) 를 통한 브레비바실러스 초시넨시스 HPD-31 의 배양 상청액의, 그의 단백질가수분해성 활성의 검출을 위한 분석이 도 2 와 같은 젤라틴 분해를 나타냈다. 한편, 바실러스 브레비스 돌연변이 균주로 칭하는, 프로테아제 활성 (단백질가수분해성 활성) 을 실질적으로 나타내지 않는 바실러스 브레비스 31-OK 가 개시되어 있다 (특허 참조문헌 3). 그러나, 젤라틴 PAGE 방법에 의한, 바실러스 브레비스 31-OK 도 그의 단백질가수분해성 활성의 평가를 위한 실험에서 그의 단백질 가수분해성 활성을 나타내는 밴드를 나타내었으며, 세포외 단백질가수분해성 활성을 완전히 잃지는 않았다. 또한, 상기 균주의 세포외 단백질가수분해성 활성의 유전자 수준 분석이 전혀 이루어지지 않았다. 구체적으로, 프로테아제가 단리되지 않았으며, 그의 유전자 서열분석은 물론, 그의 클로닝 조차도 수행되지 않았다. 따라서, 세포외 단백질가수분해성 활성이 감소되었다고 하는 균주를 사용하는 경우에도, 분비되고 생성된 단백질이, 그 균주가 여전히 가지고 있는 세포외 단백질가수분해성 활성에 의해 분해될 수 있는 가능성이 있으며, 그에 따라 단백질의 수율이 감소될 수 있다. 브레비바실러스 초시넨시스 (또는 바실러스 브레비스) 의 이러한 균주는 스크리닝 또는 돌연변이원으로의 처리, 또는 다른 방법을 통해 수득되었으나, 유전체 (genome) 상의 프로테아제 유전자의 확인 후에 추가적인 유전자의 불활성화를 통한 것이 아니었다. 따라서, 지금까지 아무도 단백질가수분해성 활성이, 유전체 상의 프로테아제 유전자의 확인 후, 추가적으로 그 유전자를 불활성화시킴으로써 감소된 브레비바실러스 초시넨시스를 알지 못한다. 이전에 기술된 브레비바실러스 초시넨시스의 단백질가수분해성 활성의 감소는 전부 그의 세포외 단백질가수분해성 활성의 감소를 위한 것이었으며, 그 균주의 세포내 단백질가수분해성 활성의 감소에 대한 관심이 없었다. 그러나, 브레비바실러스 초시넨시스를 숙주로 사용한 재조합 단백질 제조에서, 분비 생성은 불가능하나, 세포내 축적 생성은 목적되는 단백질의 유형에 따라 가능한 경우가 있다. 이러한 경우, 제조된 단백질은 세포내 프로테아제의 작용에 의해 분해될 수 있으며, 그 결과 재조합 단백질이 거의 수득되지 않는다. 브레비바실러스 초시넨시스의 세포는 배양 동안 용균이 부분적으로 일어나며, 그 결과 세포내 프로테아제를 포함하는 세포내 단백질이 배지로 용해되어 나올 수 있다. 따라서, 세포외 분비되고 생성되는 재조합 단백질 또한 용해된 세포내 프로테아제에 의해 분해될 수 있는 가능성이 있다. 따라서, 세포내 단백질가수분해성 활성을 감소시키는 것이 유전자 재조합에서 숙주로서의 브레비바실러스 초시넨시스의 유용성을 추가적으로 증가시키기 위한 목적을 위해 해결되어야 할 또 다른 문제이다. 지금까지는 브레비바실러스 초시넨시스의 세포내 단백질가수분해성 활성을 감소시키는 공지된 예가 없었다. 부가적으로, 브레비바실러스 초시넨시스의 그의 세포내 단백질가수분해성 활성에 대한 유전자-수준 분석이 전혀 수행되지 않다. 구체적으로, 브레비바실러스 초시넨시스의 세포내 프로테아제의 단리의 공지된 예가 없었다. 부가적으로, 세포내 프로테아제 유전자 클로닝의 예 및 그의 서열 확인의 예가 알려지지 않았다. 또한, 유전자 재조합에서 숙주로서 브레비바실러스 초시넨시스의 공업적 이용을 더 넓히기 위한 목적을 위해, 균주의 단백질가수분해성 활성의 감소 이외에 해결되어야 할 또 다른 문제가 여전히 존재한다. 브레비바실러스 초시넨시는 바실러스 섭틸리스와 같은 바실러스 종의 박테리아와 같이 포자를 형성할 수 있다. 생존 세포 (비-포자 세포) 와 비교하여, 포자는 높은 내열성을 가지며, 그에 따라 멸균을 위해 극심한 조건을 필요로 한다. 따라서, 배양의 종료 후 제조 라인에서 포자를 포함하는 세포의 완벽한 멸균 및 제거의 보증이 필요한 재조합 단백질 의약품의 제조에서는, 숙주로서 브레비바실러스 초시넨시스를 사용하여 상기를 제조하기 위해 매우 어려운 기술이 필요하다. 따라서, 재조합 단백질 의약품의 제조와 같은 광범위 공업용 적용에서 재조합 숙주로서 브페비바실러스 초시넨시스의 이용을 가능하게 하기 위해, 요망되는 것은 약한 멸균 조건 (60℃ 내지 100℃) 하에서도 완전히 죽고 포자를 형성하지 않는 브레비바실러스 초시넨시스 균주이다. 브레비바실러스 초시넨시스의 포자를 멸균하기 위해 필요한 조건은 바실러스 섭틸리스의 포자를 멸균시키기 위해 필요한 조건 보다 훨씬 약하다. 예를 들어, 100℃ 에서 바실러스 섭틸리스의 포자의 D 값 (다른 온도 범위에서 생존하는 세포 (비-포자 세포) 및 포자를 포함하는 모든 세포의 수를 1/10 로 감소시키는데 걸리는 시간) 은 약 11 분이나, 이는 균주의 유형에 따라 변화한다. 한편, 브레비스바실러스 초시넨시스의 포자의 D 값은 1 분 이하이다. 그러나, 브레비바실러스 초시넨시스의 포자의 멸균은 그의 생존 세포 (비-포자 세포) 의 멸균과 비교하여 매우 더 심한 조건을 필요로 한다. 예를 들어, 이하에 제공된 실시예에 나타난 바와 같이 80℃ 에서 브레비바실러스 초시넨시스의 생존 세포 (비-포자 세포) 의 D 값은 1 분 미만이나, 그의 포자의 D 값은 약 67 분이다. 바실러스 섭틸리스 SMS275 (특허 참조문헌 4: JP-A 4-287686 (1992)) 은 바실러스 섭틸리스의 비-포자 균주로 개시되어 있다. 그러나, 지금까지 포자를 형성하는 능력을 갖지 않는, 즉, 약한 멸균 조건 하에서 완전히 제거될 수 있는 브레비바실러스 초시넨시스의 어느 균주도 알려지지 않았다. 특허 문헌 1: JP-A 60-58074 (1985) 비-특허 문헌 1: Int. J. Syst. Bacteriol., 46, 939-946 (1996) 특허 문헌 2: JP-A 63-56277 (1988) 비-특허 문헌 2: Ann. NY Acad. Sci., 782, 115-122 (1996) 특허 문헌 3: JP-A 6-296485 (1994) 특허 문헌 4: JP-A 4-287686 (1992)