단백질 document_id A220623042120

지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 효소는 오랫동안 알려져 왔다(Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493 참조). 특히 식물 및/또는 포유류 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LACATs)와 같은 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(GCATs)는 포스파티딜콜린과 콜레스테롤 사이의 지방산 전이를 촉매할 것으로 발견되었다. Upton and Buckley(TIBS 20, May 1995, p178-179) 및 Brumlik and Buchkey(J. of Bacteriology Apr. 1996, p2060-2064)는 수성 배지 내에서 알코올 수용체로의 아실 전이를 수행할 수 있는 능력을 지닌 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로부터의 리파제/아실트랜스퍼라제를 보고한다. 본 효소에 대해 아에로모나스 하이드로필라 아실트랜스퍼라제의 추정 기질 결합 도메인 및 활성 사이트가 확인되었다(Thornton et al 1988 Biochem. et Biophys. Acta. 959, 153-159 and Hilton 0026# Buckley 1991, J. Biol. Chem. 266, 997-1000 참조). Buckley et al(J. Bacteriol 1996, 178(7)2060-4)는 Ser16, Asp116 및 His291가 유지되는 효소 활성에 대해 보유되어야 하는 필수적 아미노산임을 보고하였다. Robertson et al(J. Bio. Chem. 1994, 269, 2146-50)은 본 발명에 포함되지 않은 아에로모나스 하이드로필라 아실트랜스퍼라제의 일부 특이적 돌연변이 즉, Y226F, Y230F, Y30F, F13S, S18G, S18V를 보고하였다. 발명의 요약 관점 본 발명은 모효소와 비교시 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌, 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 포함한 GDSx의 특이적 변이체의 발견을 나타낸다. 특히 본 발명에 따른 변이체는 모효소와 비교시 아실 공여체로서 갈락토리피드를 이용하는 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다. 이들 지질 아실트랜스퍼라제는 여기서 당지질 아실트랜스퍼라제로 표기된다. 본 발명에 따른 변이체는 인지질 트랜스퍼라제 활성(GL:PL 비율)과 비교시 아실 공여체로서 갈락토리피드를 이용하는 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율 및/또는 갈락토리피드 가수분해 활성(GLt:GLh 비율)과 비교시 아실 공여체로서 갈락토리피드를 이용하는 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율을 추가적으로 지닌다. 첫 번째 관점에 따라 본 발명은 본 발명은 (a) 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하는 지질 아실트랜스퍼라제 효소인 모효소를 선택하는 단계; (b) 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 생성하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계; (c) 갈락토리피드 기질 및 선택적으로는 인지질 기질 및/또는 선택적으로는 트리글리세리드 기질 상에서의 활성에 대해 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; (d) 모효소와 비교시 갈락토리피드에 대해 증가된 활성을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계; 및 선택적으로는 (e) 다량의 변이 효소를 제조하는 단계를 포함한 변이 당지질 아실트랜스퍼라제의 제조 방법을 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7에서 한정된(하기 한정됨) 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 여기에 설명된 바와 같이 상기 모서열이 바람직하게는 1IVN.PDB 및/또는 1DEO.PDB와의 P10480 결정 구조 배위의 구조적 정렬에 의해 수득된 여기에 한정된 P10480의 구조적 모델과 구조적으로 정렬됨으로서 확인된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 상세하게 설명된(하기 한정됨) 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다. 또한 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 설명된 바와 같이 최상의 일치 중복을 보증하기 위해 상기 모서열이 pfam 공통 서열(consensus sequence)(서열번호: 1)에 정렬되고 P10480의 구조적 모델에 따라 변형될 때 확인된 세트 2에서 지침된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명은 서열번호 2와의 서열 정렬에 의해 확인된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7(하기 한정됨)에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 제공한다. 또다른 관점에따라 본 발명은 여기에 설명된 바와 같이 상기 모서열이 바람직하게는 1IVN.PDB 및/또는 1DEO.PDB와의 P10480 결정 구조 배위의 구조적 정렬에 의해 수득된 여기에 한정된 P10480의 구조적 모델과 구조적으로 정렬됨으로서 확인된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 제공한다. 또다른 관점에 따라 본 발명은 설명된 바와 같이 최상의 일치 중복(도 55 참조)을 보증하기 위해 상기 모서열이 pfam 공통 서열(서열번호: 1)에 정렬되고 P10480의 구조적 모델에 따라 변형될 때 확인된 세트 2에서 지침된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 제공한다. 또한 본 발명은 부분적 가수분해 생성물 즉, 리소-당지질(lyso-glycolipid)을 생성하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 당지질(즉, 디갈락토실 디글리세리드(DGDG) 또는 모노갈락토실 디글리세리드(MGDG))을 처리함으로서 디갈락토실 모노글리세리드(DGMG) 또는 모노갈락토실 모노글리세리드(MGMG)와 같은 리소-당지질을 제조하기 위해 기질(바람직하게는 식료품)의 제조시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 당지질분해효소의 이용을 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명은 부분적 가수분해 생성물 즉, 리소-인지질(lyso-phospholipid)을 생성하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 인지질(즉, 레시틴)을 처리함으로서 리소레시틴과 같은 리소-인지질을 제조하기 위해 기질(바람직하게는 식료품)의 제조시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 이용을 제공한다. 하나의 관점에서 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소를 하나 이상의 식료품 성분에 첨가하는 것을 포함한 식료품의 제조 방법에 관한 것이다. 또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소를 반죽에 첨가하는 것을 포함한, 반죽으로부터의 베이크된 제품의 제조 방법에 관한 것이다. 또다른 관점에서 본 발명은 리소인지질을 제조하기 위한 계란-주성분 제품의 제조시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 이용을 제공한다. 또다른 관점에서 리소인지질을 제조하기 위해 계란 또는 계란-주성분 제품에 본 발명에 따른 변이 지질분해효소를 첨가하는 것을 포함한 계란 또는 계란-주성분 제품의 시험 방법이 제공된다. 본 발명의 변이체는 WO02/065854호와 유사한 인스턴트 국수와 같은 스낵 음식의 제조 방법에 이용된다. 본 발명은 바람직한 기술적 효과 또는 예를 들어 식료품(''기술적 효과''에 기입된 바와 같은) 내에서의 기술적 효과의 결합을 유발하기 위해 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제의 이용에 관한 것이다. 또다른 관점에서 본 발명은 극성 지질(즉, 인지질 및/또는 당지질)의 주요 부분을 가수분해하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 식용유 또는 식물유를 처리하는 것을 포함한, 식물유 또는 식용유의 효소적 탈검(degumming) 방법을 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소와 상기 인지질을 혼합시키는 것을 포함한, 지방 아실 그룹을 가수분해하기 위해 인지질을 처리하는 것을 포함한 방법을 제공한다. 또다른 관점에서 본 발명은 인지질의 주요 부분을 가수분해하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 기름을 처리하는 단계 및 기름으로부터 가수분해된 인지질을 함유한 수성상을 분리하는 단계를 포함한 식용유 내의 인지질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 또한 지질분해효소의 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 것이 가능한 숙주 세포를 상기 변이 지질분해효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한 재조합 핵산으로 형질전환시키는 단계 및 핵산이 발현되는 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 변이 지질분해효소를 채취하는 단계를 포함한 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 제조 방법이 제공된다. 또다른 관점에서 본 발명은 탄수화물 에스테르 및/또는 단백질 에스테르 및/또는 단백질 서브유니트 에스테르 및/또는 히드록시산(hydroxy acid) 에스테르와 같은 고가 생성물을 제조하기 위해 극성 지질(바람직하게는 당지질)의 생물변환(bioconversion)시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 이용에 관한 것이다. 극성 지질을 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소와 혼합시키는 것을 포함한 극성 지질(바람직하게는 당지질)을 고가 생성물로 생물변환시키는 방법. 또한 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 고정된 변이 지질분해효소에 관한 것이다. 본 발명의 관점은 청구범위 및 하기 설명에 나타나 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 또다른 관점은 하기를 포함한다: 본 발명의 서열을 포함한 컨스트럭트; 본 발명에서 사용된 서열을 포함한 벡터; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 플라스미드; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 세포; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 조직; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 기관; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 숙주; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 생물체. 또한 본 발명은 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 이용하여 이를 발현시키는 방법을 포함한다; 이를 이전시키는 방법을 포함. 또한 본 발명은 숙주 세포로부터의 분리와 같이 뉴클레오타이드 서열을 분리하는 방법을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 아미노산 서열에 관한 또다른 관점은 하기를 포함한다: 본 발명에 사용되기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 컨스트럭트; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 벡터; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 플라스미드; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 세포; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 조직; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 기관; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 숙주; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 생물체. 또한 본 발명은 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 이용하여 이를 정제하는 방법을 포함한다; 이를 이전시킨 후 상기 서열을 정제하는 방법을 포함. 참고를 용이하게 하기 위해 본 발명의 이들 및 또다른 관점이 적당한 섹션 표제로 논의된다. 그러나 각 섹션 하의 지침은 특정한 섹션에 항상 한정적인 것은 아니다.