ＬＰＡ 수용체의 작용제와 길항제 및 사용 방법 document_id A220623042138

형질전환되지 않은 모든 세포는 그들의 생존 및 증식을 위해 성장 인자를 필요로 한다. 폴리펩티드 성장 인자 이외에, 성장 인자 유사 특성을 보유하는 최근 출현한 부류의 지질이 발견되었으며, 이들은 총괄하여 인지질 성장 인자(PLGF; Phospholipid growth factor)라 공지되어 있다. 대부분의 정지 세포의 증식 유도에서 그들의 유사한 약리학적 활성에도 불구하고(Jalink 등, 1994a; Tokumura, 1995; Moolenaar 등, 1997), PLGF는 구조적으로 2개의 넓은 카테고리로 하위 분할할 수 있다. 첫번째 카테고리는 글리세롤 백본을 보유하는 글리세로인지질 매개자(GPM)를 함유한다. GPM의 예로는 LPA, 포스파티드산(PA), 환식 포스파티드산(환식-PA), 알케닐 글리세롤 포스페이트(알케닐-GP) 및 라이소포스파티딜 세린(LPS)을 들 수 있다. 두번째 카테고리는 스핑고이드 베이스 모티프를 보유하는 스핑고지질 매개자(SPM)를 함유한다. SPM의 예로는 스핑고신-1-포스페이트(SPP), 디히드로스핑고신-1-포스페이트, 스핑코실포스포릴콜린(SPC) 및 스핑고신(SPH)을 들 수 있다. LPA(Tigyi 등, 1991; Tigyi 및 Miledi, 1992), PA(Myher 등, 1989), 알케닐-GP(Liliom 등, 1998), 환식-PA(Kobayashi 등, 1999), SPP(Yatomi 등, 1995) 및 SPC(Tigyi 등, 2000)는 혈청에서 검출되어 왔다. 이들 지질 매개자는 동정되었고 그 특성 또한 규명되어 왔다. 혈청 및 혈장 내에는 성장 인자 유사 특성을 나타내는 아직 알려지지 않은 PLGF가 존재한다(Tigyi 및 Miledi, 1992). LPA(농도 약 20 μM)는 혈청내에 존재하는 가장 풍부한 PLGF이다(Tigyi 및 Miledi, 1992; Jalink 등, 1993). 진핵 세포에서, LPA는 소포체(ER) 막에서 주로 일어나는 인지질 생합성 초기 단계의 중요한 중간체이다(Bosch, 1974; Bishop 및 Bell, 1988). ER에서, LPA는 글리세롤-3-포스페이트에 대한 아실-CoA의 작용으로부터 유도되는데, 이는 더 아실화되어 PA를 형성한다. LPA의 PA로의 아실화 속도는 매우 빠르기 때문에, 생합성 부위에 LPA는 거의 축적되지 않는다(Bosch, 1974). LPA는 ER에 한정되기 때문에, 대사 중간체로서의 그의 역할은 신호전달 물질로서의 그의 역할과는 거의 무관하다고 볼 수 있다. LPA는 혈청의 구성성분이며, 그의 레벨은 낮은 마이크로몰(μM) 범위이다(Eicholtz 등, 1993). 이 레벨은 예측되는데, 그 이유는 LPA가 응집 과정중에 활성화된 혈소판으로부터 방출되기 때문이다(Tigyi 및 Miledi, 1992; Eicholtz 등, 1993). 혈청중에 존재하는 LPA는 알부민에 결합되며, 전혈장 대부분의 열 안정성 비투석성 생물학적 활성에 기여한다(Moolenaar, 1994). 제노퍼스 난모세포에서 내향성 클로라이드 전류(chloride-currents)를 유발하는 데 기여하는 활성 혈청 성분은 LPA(18:0)으로 동정되었다(Tigyi 및 Miledi, 1992). 대형 알부민 결합된 LPA(18:0)는 라이소-PC에 대한 라이소포스포리파제 D(PLD)의 작용에 의해서라기 보다는 응집 과정 중에 생성된다. 후자의 경로는 헤파린 또는 시트레이트 + 덱스트로즈의 작용에 의해 응집되지 않은 '노화된' 혈장내 LPA의 존재에 기여한다(Tokumura 등, 1986). 지적하고 싶은 다른 관점은 LPA가 EDTA로 처리한 혈장 내에 존재하지 않는다는 것이다. 이러한 사실은 혈장 라이소포스포리파제가 Ca2+-의존성일 수 있음을 암시하는 것이다(Tokumura 등, 1986). 알부민의 역할은 혈청 내에 존재하는 포스포리파제의 작용으로부터 LPA를 보호하는 것이다(Tigyi 및 Miledi, 1992). Tigyi 및 Miledi는 알부민이 혈류 내에서 LPA의 담체로서 작용할 뿐만 아니라, 그의 생리학적 반감기를 증가시킨다고 제안하였다. 혈장 알부민 중에서는 제노퍼스(Xenopus) 난모세포 내에서 클로라이드 전류를 유발함에 있어서 LPA의 작용을 모방하는 아직 동정되지 않은 지질 매개자가 존재한다. LPA-반응성 세포 유형은 점균 아메바 및 제노퍼스 난모세포로부터 포유동물 체세포까지 확장된다. 따라서, LPA 소스 및 그의 방출은 단지 활성화된 혈소판에 국한되지는 않을 수 있는 것으로 생각된다. 최근 실험 결과로부터 밝혀진 바와 같이, 펩티드 성자 인자에 의한 자극시, 포유동물 섬유아세포는 LPA를 신속하게 생성하며, 이는 후속적으로 세포외 매질로 방출된다(Fukami 및 Takenawa, 1992). 알려지지 않은 세포에서 기원한 비교적 많은 양의 생활성 LPA가 난소암 환자의 복수에 존재한다는 증거(Xu 등, 1995a), 상기 환자로부터 유래한 복수는 난소암 세포에 대한 강력한 활성을 보유한다는 증거(Mills 등, 1988; Mills 등, 1990)가 존재한다. 상기 생활성 LPA가 종양 세포로부터 세포외 유체로 분비된다거나, 백혈구에 의해 분비된다거나 또는 여러가지 포스포리파제의 작용에 의해 더 복잡한 지질로부터 생성된다거나 하는 점은 아직 미제로 남아있다. GPM 및 SPM은 계통수(phylogenetic tree)에 걸치는 매우 다양한 세포성 반응을 유발한다(Jalink 등, 1993a). LPA는 뉴런 세포(Jalink 등, 1993; Durieux 등, 1992), 혈소판 세포, 정상 세포 뿐만 아니라 형질전환된 섬유아세포(Jalink 등, 1990), 내피 세포(van Corven 등, 1989; Moolenaar, 1991) 및 제노퍼스 난모세포(Tigyi 및 Miledi, 1992; Durieux 등, 1992; Fernhout 등, 1992)와 같은 여러가지 세포 내의 내세포성 저장물(store)로부터 유래하는 일시적인 Ca2+ 신호를 유도한다. LPA는 혈소판 응집을 유도하며(Schumacher 등, 1979; Tokumura 등, 1981; Gerrard 등, 1979; Simon 등, 1982), 평활근 수축을 유도하며(Tokumura 등, 1980; Tokumura 등, 1994), 정맥내 투여시 혈압의 종 의존성 변화를 유도한다(Schumacher 등, 1979; Tokumura 등, 1978). LPA를 정지 섬유아세포에 첨가하는 경우, LPA는 DNA 합성 및 세포 분열을 촉진시킨다(van Corven 등, 1989; van Corven 등, 1992). LPA의 성장 유사 효과는 펩티드 성장 인자의 존재를 필요로 하지 않는다. 이러한 관찰로부터 확인할 수 있는 것은 LPA가 세포 증식을 억제하는 인슐린 또는 상피성 성장 인자(Moolenaar, 1991)의 존재를 필요로 하는 엔도텔린 또는 바소프레신과 다르다는 것이다. 강조하고 싶은 점은 Sp2 골수종 세포에서, LPA는 cAMP 레벨 증가에 의해 매개되는 항분열촉진성 반응에 기여한다는 것이다(Tigyi 등, 1994; Fischer 등, 1998). 분열촉진성 경로와는 달리, 항분열촉진성 경로는 페르투시스 독소(PTX)에 의해 영향받지 않는다. 또한, 포르스콜린 및 이소부틸 메틸 잔틴의 첨가시, Sp2 골수종 세포 내에서 LPA의 항분열촉진성 작용은 부가적이다(Tigyi 등, 1994). 여러 세포 유형에서, LPA는 섬유아세포에서 국소 부착 및 스트레스 섬유의 형성을 포함하는 세포골격의 변화를 유발한다(Ridley 및 Hall, 1992). 또한, LPA는 성장하는 신경돌기의 수축을 유도함으로써 신경아세포종 분화의 역전 및 억제를 촉진한다(Jalink 등, 1994a; Jalink 등, 1994b). 나노몰(nmol)의 LPA를 혈청-기아 N1E-115 신경아세포종 세포에 첨가하면 즉각적인 신경돌기 수축이 일어나며, 이는 신속하나 일시적인 세포체의 라운딩화를 수반한다(Jalink 등, 1993b). LPA가 계속 존재하는 경우, 신경아세포종 세포는 그들의 미분화된 표현형을 유지하나, 유사분열을 수행하지는 않는다(Jalink 등, 1993b). 추가 인자, 예를 들어 인슐린 유사 성장 인자는 세포 주기의 진행을 위해 필요하다. 일단 세포가 형태학적 분화를 수행하면, LPA의 첨가는 이 형태학적 변화를 역전시킨다. 따라서, LPA 유도된 신경돌기 수축은 기저(substratum)에 대한 접착 상실에 기인하는 것이라기 보다는 액틴-세포골격의 수축에 기인하는 것이다(Jalink 등, 1993b; Jalink 등, 1994b). 다른 생리학적 주화성제(예를 들어, 인터류킨-8)와 유사한 LPA는 인간 단핵구에서 주촉성 메카니즘에 의해 세포 이동을 유도한다(Zhou 등, 1995). 세포 이동의 유도 이외에, LPA는 중피 세포의 단층 내로 간암 및 암종 세포의 침입을 촉진한다(Imamura 등, 1993). 상기 침입의 기초 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았으나, 증강된 세포 이동성 및 증가된 세포 접착에 기인하는 것일 수 있다. 최종적으로, LPA는 신생아 심근 세포 아포토시스를 차단하는 것으로 알려져 있다(Umansky 등, 1997). 독특한 천연 인지질, 즉 환식-PA는 세포 유형에 따라 GPM과 유사하거나 반대되는 세포 작용에 기여하는 것으로 확인되었다. 제노퍼스 난모세포에 대해 테스트하는 경우, 이는 다른 GPM과 꽤 유사하게 클로라이드 전류를 유발하나; 그의 반응은 LPA에 의해 탈감작되지 않는다(Fischer 등, 1998). Murakami-Murofushi 등(1993)으로부터 확인된 바와 같이, 환식-PA는 증식을 유도하는 LPA와는 달리 항증식 작용을 나타냈다. PLGF 수용체(PLGFR)는 7-경막(7 TM) 구아닌 뉴클레오티드-결합 조절 단백질(G 단백질)-커플링된 수용체(GPCR) 수퍼훼밀리에 속한다. 7 TM GPCR은 이종삼량체성 G 단백질과의 상호작용을 통해 그들의 세포성 반응을 매개하는 세포 표면 수용체의 훼밀리이다. EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24를 포함하는 다수의 LPA 수용체가 동정되었다. 이들 LPA 수용체 및 기타 수용체의 관련성을 나타내는 계통수는 도 1에 도시하였다. 1996년에, Hecht 등은 차등 하이브리드화 기법을 이용하여 마우스 신피질 세포주로부터 추정적인 세르펜틴 수용체를 코딩하는 cDNA를 클로닝하였다(Hecht 등, 1996). 상기 유전자는 심실 영역 유전자-1(Vzg-1)이라 칭한다. 상기 유전자는 신피질 신경인성 영역 내에서 발현되며, 분자량 41 kDa(364 아미노산)의 단백질을 코딩한다. Vzg-1은 내피 분화 유전자-2(EDG-2)라 칭하는 미공개 양 서열(unpublished sheep sequence)와 매우 유사하다. 또한, 동일한 cDNA가 마우스 및 소 라이브러리로부터 고아(orphan) 수용체로서 분리되었으며, recl.3으로 공지되어 있다(Macrae 등, 1996). 이는 마우스 조직에 널리 분포되어 있는데, 특히 뇌와 심장에서 높게 발현된다. 1996년에, Guo 등은 PCR 기초한 프로토콜을 이용하여 제노퍼스 난모세포로부터 다른 추정적인 LPA 수용체 PSP-24(372 아미노산)를 분리하였다(Guo 등, 1996). 이 수용체는 Vzg-1/EDG-2/recl.3과 거의 유사하지 않은 것으로 확인되었다(Guo 등, 1996). EDG-2 인간 LPA 수용체의 cDNA 서열을 이용하여 스핑고지질 수용체에 대한 서열 기초한 조사를 통해 서로 밀접하게 관련된 2개의 GPCR, 즉 래트 H218(EDG-5, 354 아미노산) 및 EDG-3(378 아미노산)이 유도되었다(An 등, 1997a). 노던 분석을 통해 심장 조직에서 EDG-3 및 EDG-5를 코딩하는 mRNA가 높게 발현되는 것을 확인하였다. LPA에 대한 기능적인 수용체로서 EDG-2의 최근 동정은 An 등이 LPA 수용체의 신규 아형에 대한 서열 기초한 조사를 수행하도록 촉구하였다(An 등, 1998a). GPCR을 코딩하는 인간 cDNA가 발견되었으며, EDG-4로 명명하였다(An 등, 1998a). 노던 블롯 분석을 통해 확인한 바와 같이, EDG-2 및 EDG-4는 둘 다 GPM 수용체로서 기능함에도 불구하고, 그들의 조직 분포는 매우 상이하였다. EDG-2와는 달리, EDG-4는 일차적으로 말초 혈액 백혈구 및 고환에서 발현되었다(An 등, 1998a). 인간 주르카트 T 세포로부터 유래한 cDNA의 PCR 증폭으로 EDG 훼밀리에 속하는 이전에 미지였던 GPCR을 동정하여다. 동정된 GPCR은 EDG-7로 명명하였다. 그의 분자량은 40 kDa(353 아미노산)이었다. 인간 조직에서 EDG-7의 노던 블롯 분석으로 확인한 바와 같이, 이는 심장, 췌장, 전립선 및 고환에서 발현되었다(Bandoh 등, 1999). 따라서, 두가지의 명백한 PLGF 수용체 훼밀리, 즉 PSP24 및 EDG가 존재하며; 전체적으로 10개의 개별적인 PLGFR이 존재한다(도 1). 목록은 계속 증가되고 있다. 이들 여러가지 수용체는 GPM 또는 SPM에 대한 그들의 리간드 특이성에 기초하여 분류할 수 있는데, 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 제노퍼스 PSP24 및 쥐과동물에서 발현된 PSP24는 특이적으로 GPM(LPA, Fischer 등, 1998) 촉발된 진동성 클로라이드 전류를 특이적으로 변환시킨다. 이들은 EDG 훼밀리와 구조적으로 일치하진 않는다(Tigyi 및 Miledi, 1992; Fernhout 등, 1992). EDG 훼밀리는 2개의 현저한 하위 그룹으로 나눌 수 있다. 첫번째 군은 EDG-2, EDG-4 및 EDG-7을 포함하며, 이들은 단지 GPM에 대한 수용체로서 기능하며(Hecht 등, 1996; An 등, 1998a; Bandoh 등, 1999; An 등, 1998b), 리간드 결합에 반응하여 다수의 신호를 전달한다. 두번째 군은 EDG-1, EDG-3, EDG-5, EDG-6 및 EDG-8을 포함하며, SPM에 특이적이다(An 등, 1997a; Im 등, 2000; van Brocklyn 등, 1998; van Brocklyn 등, 2000; Spiegel 및 Milstein, 2000). 여러가지 PLGFR의 원칙적인 조직 발현은 하기 표 2에 나타냈다. PLGF는 다수의 G-단백질-매개된 신호 전달 현상을 활성화시킨다. 이들 과정은 이종삼량체성 G-단백질 훼밀리 Gq/11, Gi/0 및 G12/13을 통해 매개된다(Moolenaar, 1997; Spiegel 및 Milstein, 1995; Gohla 등, 1998). Gq/11 경로는 포스포리파제 C(PLC) 활성화에 기여하는데, 이는 여러 세포에서 Ca2+의 후속 고정화를 이용하여 이노시톨 트리포스페이트(IP3) 생성을 유도한다(Tokumura, 1995). 몇몇 세포에서, 이 반응은 PTX-민감성인데, 이는 다수의 PTX-민감성 경로 및 비민감성 경로가 연루됨을 의미하는 것이다(Tigyi 등, 1996). 또한, 이 경로는 단백질 키나제 C(PKC)의 디아실 글리세롤(DAG)-매개된 활성화에 기연하다. PKC는 세포성 포스포리파제 D(PLD)를 활성화시키는데, 이는 포스파티딜 콜린을 유리 콜린과 PA로 가수분해하는데 기여한다(van der Bend 등, 1992a). 또한, PLC는 몇몇 세포 유형에서 PKC의 DAG 활성화에 의해 또는 직접적으로 MAP 키나제를 활성화시킬 수 있다(Ghosh 등, 1997). 분열촉진성 신호전달 경로는 G-단백질 이종삼량체성 Gi/0 서브유닛을 통해 매개된다. 형질감염 연구를 통해 확인된 바와 같이, αi 서브유닛 보다는 오히려 Giβγ 이량체가 Ras-MAP 키나제 활성화에 기여한다. Ras의 활성화는 수용체 티로신 키나제(RTK), 예를 들어 EGF(Cunnick 등, 1998) 또는 PDGF 수용체(Herrlich 등, 1998)의 트랜스활성화(transactivation)에 의해 진행된다. 트랜스활성화된 RTKS는 Ras를 활성화시키는데, 이는 Raf에 의해 MAP 키나제의 활성화를 유도한다. PTX-민감성인 Giα 서브유닛은 아데닐릴 사이클라제(AC)를 억제하는데, 이는 결국 상기 수용체를 인산화시켜 탈감작시키는 G-단백질-커플링된 수용체 키나제(GRK)에 대한 βγ이량체 도킹으로 귀착된다. 상기 인산화된 수용체는 β-아레스틴에 의해 소집되고, 따라서 EGF-수용체를 인산화시키는 src 키나제를 소집하여 그의 활성 형태를 생성시킨다(Lin 등, 1997; Ahn 등, 1999; Luttrell 등, 1999). 이어서, 트랜스활성화된 RTK는 Ras를 활성화시키는데, 이는 Raf에 의해 MAP 키나제(ERK 1,2)의 활성화를 유도한다. PTX-민감성인 Giα 서브유닛은 AC를 억제하는데, 이는 결론적으로 환식-AMP(c-AMP)의 레벨 감소로 귀착된다. LPA에 의한 반대되는 세포성 효과, 즉 유사분열생식 및 항유사분열생식은 cAMP 2차 전달자 시스템에 대한 반대 효과를 수반한다. 유사분열생식은 결론적으로 cAMP 레벨을 감소시키는 Giα 경로를 통해 매개되는 반면(van Corven 등, 1989; van Corven 등, 1992), 항유상분열생식은 cAMP의 비PTX 민감성 Ca2+-의존성 증가를 수반한다(Tigyi 등, 1994; Fischer 등, 1998). 대조적으로, 액틴-세포골격의 재배열을 유도하는 PTX-민감성 G12/13 신호전달 경로에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 또한, 이 경로는 RTK의 트랜스활성화와 관련이 있을 수 있으며(Lin 등, 1997; Ahn 등, 1999; Luttrell 등, 1999; Gohla 등, 1998), 작은 GTPase인 Rho 상에 집중된다. Rho의 하류 신호전달에 대해서는 훨씬 더 많은 것이 알려져 있는데, 그 이유는 여러가지 단백질 파트너가 분리 및 동정되었기 때문이다. Rho는 미오신 경쇄 포스파타제(MLC-포스파타제)를 인산화시켜 결론적으로 이를 억제하는 Ser/Thr 키나제를 활성화시킨다(Kimura 등, 1996). 이 경로는 MLC의 인산화된 형태를 축적시키 신경돌기의 수축과 유사한 세포성 효과를 유발하는 세포골격 반응(Tigyi 및 Miledi, 1992; Tigyi 등, 1996; Dyer 등, 1992; Postma 등, 1996; Sato 등, 1997), 스트레스 섬유의 유도(Ridley 및 Hall, 1992; Gonda 등, 1999), 주화성의 자극(Jalink 등, 1993a), 세포 이동(Zhou 등, 1995; Kimura 등, 1992) 및 종양 세포 침입성(Imamura 등, 1993; Imamura 등, 1996)을 유발한다. PLGF-유도되고 Rho-매개된 종양 세포 침입성은 ADP-의존성 메카니즘에서 Ro를 특이적으로 리보실화하는 씨. 보툴리늄(C. Botulinium) C3-독소에 의해 차단된다(Imamura 등, 1996). 또한, Rho는 정지 섬유아세포에서 DNA 합성을 자극할 수 있는 능력을 보유하고 있다(Machesky 및 Hall, 1996; Ridley, 1996). Rho 훼밀리 GTPase의 발현은 초기 유전자 전사를 매개하는 혈청 반응 인자(SRF)를 활성화시킨다(Hill 등, 1995). 또한, PLGF(LPA)는 종양 세포 침입을 유도한다(Imamura 등, 1996); 그러나, 이것이 세포골격 변화 또는 유전자 전사 또는 둘 다와 관련되어 있는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. 다수의 세포성 경로 및 세포 활성, 예를 들어 증식 및/또는 이동에 대한 LPA/LPA 수용체의 관련성, 뿐만 아니라 상처 치료 및 암에서의 관련성으로 인해, 이는 상기 동정된 LPA 수용체에서 길항제 또는 작용제로서 작용할 수 있는, 바람직하게는 선택적으로 작용할 수 있는 신규 화합물을 확인하는 데 바람직하다. 현재 밝혀진 합성 또는 내재성 LPA 수용체 억제제는 거의 없다. 현재까지 보고된 길항제 중에, 가장 잘 알려진 것은 SPH, SPP, N-팔미토일-1-세린(Bittman 등, 1996) 및 N-팔미토일-1-티로신(Bittman 등, 1996)에 작용하는 것이다. 상기 화합물은 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류를 억제하는 것으로 공지되어 있다(Bittman 등, 1996; Zsiros 등, 1998). 그러나, 이들 화합물은 모든 세포 시스템에서 연구된 것은 아니다. 또한, SPP는 종양 세포 침입성을 억제하는 것으로 공지되어 있으나, SPP가 LPA의 억제제로서 또는 그 자신의 수용체의 작용에 의해 그러한 작용을 하는지에 대해서는 밝혀진 바 없다. 또한, N-팔미토일-1-세린 및 N-팔미토일-1-티로신은 LPA-유도된 혈소판 응집을 억제하나(Sugiura 등, 1994), 이들 화합물이 LPA 수용체에서 작용하는지 여부는 아직 미확립된 상태로 남아있다. 라이소포스파티딜 글리세롤(LPG)은 LPA 작용을 어느 정도 억제하는 것으로 밝혀진 최초의 지질이지만(van der Bend 등, 1992b), 몇몇 LPA-반응성 세포 유형에서 검출할 수 없었다(Liliom 등, 1996). 이들 억제제 중에서 특이적인 LPA 수용체에서 선택적으로 작용하는 것으로 확인된 것은 없다. 폴리설폰화된 화합물인 수라민은 가역적이며 투여량 의존성 반식으로 LPA-유도된 DNA 합성을 억제하는 것으로 확인되었다. 그러나, 수라민은 LPA 수용체에 대한 임의의 특이성은 없으며, 단지 매우 높은 밀리몰(mM) 농도에서만 LPA의 작용을 차단하는 것으로 확인되었다(van Corven 등, 1992). 본 발명은 현재 LPA 작용제 및 LPA 길항제와 관련된 결점을 극복하는 것이다.