핵산 구조물 document_id A220623042139

유전자 치료 및 핵산 면역화는 후천성 및 선천성 질환 모두에 대한 치료 및 예방을 위한 기대되는 접근법이다. 이들 기술은 목적하는 핵산을 피검물 (subject)에 전달하여 생체 내에서 발현시키는 것을 제공한다. 전달은 피검물 세포 또는 조직을 생체 외에서 트랜스펙션시키고 형질전환된 물질을 숙주에 재도입함으로써 수행될 수 있다. 다르게는, 핵산을 수용체에 직접적으로 생체 내에서 투여할 수 있다. 이러한 기술은 각각 충분량의 치료적 또는 항원적 유전자 생성물을 제공하기 위해 트랜스펙션된 세포에서 핵산의 효과적인 발현을 필요로 한다. 트랜스펙션 효율, 목적하는 유전자 또는 서열이 전사되고 mRNA가 해독되는 효율을 포함하는, 수개의 인자가 수득되는 발현 수준에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 많은 발현 시스템이 당 기술 분야에서 기술되어 있으며, 통상적으로 이들은 각각 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 목적하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터로 이루어져 있다. 이들 조절 서열은 전사 프로모터 서열 및 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 포유동물 세포 발현 시스템을 위한 통상 사용되는 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 즉시형 초기 (immediate early) 프로모터 (Chapman et al (1991) Nucl. Acids Res. 19: 3979-3986), 마우스 유방암 바이러스 긴 말단 반복 (long terminal repeat: LTR) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (adenovirus major late promoter: Ad MLP) 및 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus: HSV) 프로모터를 포함한다. 비바이러스성 프로모터, 예를 들어 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 프로모터도 일반적으로 사용된다. 발현 시스템은 종종 전사 조절자 요소 ("인핸서"로 언급함)를 포함한다. 인핸서는 광범위하게는 프로모터/유전자 서열에 작동적으로 연결되었을 때 유전자 서열의 전사를 증가시키는 시스-작용제 (cis-acting agent)로 정의된다. 인핸서는 다른 발현 조절 요소 (예: 프로모터)보다 목적하는 서열로부터 훨씬 더 떨어진 위치에서 작용할 수 있으며, 목적하는 서열에 대해 양쪽 배향으로 위치되었을 때 작동할 수 있다 (Banerji et al. (1981) Cell 27: 299-308, deVilleirs et al. (1981) Nucl. Acids Res 9: 6251-6264). 인핸서는 폴리오마 바이러스, BK 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 시미안 바이러스 40 (SV40), 몰로니 육종 바이러스, 소 유두종 바이러스 및 로우즈 육종 바이러스를 포함한 다수의 바이러스 기원으로부터 확인되었다 (deVilleirs et al. 상기 참조, Rosenthal et al. (1983) Science 222: 749-755, Hearing et al. (1983) Cell 33: 695-703, Weeks et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 1222-1234, Levinson et al. (1982) Nature 295: 568-57S, 및 Luciw et al. (1983) Cell 33: 705-716). 핵산 면역화 및 유전자 치료를 위한 많은 발현 시스템은 hCMV 즉시형 초기 프로모터를 사용한다. 미국 특허 번호 제5168062호 및 제5385839호 (Stinski) 및 EP 특허 번호 제0323997 B1호를 참조한다. hCMV 즉시형 초기 프로모터를 사용하는 발현 벡터는, 예를 들어 pWRG7128 (Roy et al, Vaccine 19,764-778, 2001), 및 pBC12/CMV 및 pJW4303 (국제 공개 번호 제WO 95/20660호에서 기술됨)을 포함한다. 챕먼 등 (Chapman et al (1991))은 hCMV 인트론 A의 부재 하에서 hCMV 즉시형 초기 프로모터로부터의 감소된 발현 수준을 보고하였다. 발명의 요지 숙주 세포에서 이종의 코딩 서열의 발현을 향상시키는, 조작된 바이러스성 프로모터/발현 서열을 사용하는 핵산 구조물을 개발하였다. 이 구조물은 항원-암호화 유전자의 효과적인 발현에 적합하여, 핵산 면역화에 사용될 수 있다. 특히, 이 구조물은 입자-매개된 핵산 면역화에 사용하기 위해 캐리어 입자에 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열; (b) hCMV 주요 즉시형 초기 (major immediate early) 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부분의 엑손 2; 및 (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종 인트론 을 포함하는 키메릭 프로모터 서열 및 이와 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 삽입을 위한 클로닝 부위를 포함하는 핵산 구조물을 제공한다. 또한, 본 발명은 (i) (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열; (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부분의 엑손 2; 및 (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종 인트론을 포함하는 키메릭 프로모터 서열; 및 (ii) 상기 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 삽입을 위한 클로닝 부위; 및 (iii) (a) HBV preS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 상기 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-해독 리더 서열; 및/또는 (b) HBsAg (hepatitis B virus surface antigen) 서열의 3' 비해독 영역 (UTR) 또는 시미안 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고 상기 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며 클로닝 부위의 아래에 있는 인핸서 서열을 포함하는 핵산 구조물; (i) 프로모터 서열; (ii) HBV preS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되는 비-해독 리더 서열; 및 (iii) (i) 및 (ii)에 작동적으로 연결되고 비-해독 리더 서열에 이종인 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물; (i) 프로모터 서열; (ii) 프로모터 서열 (i)에 작동적으로 연결된 코딩 서열; 및 (iii) 코딩 서열 (ii)의 3'에 존재하고 이에 작동적으로 연결된 인핸서 서열을 포함하고, 인핸서 서열 (iii)이 HBsAg 서열의 3'UTR 또는 시미안 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되며, 코딩 서열 (ii)가 3' 인핸서 서열에 이종인 핵산 구조물; 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 핵산 구조물을 포유동물 세포에 전달하는 단계를 포함하여, 목적하는 폴리펩티드를 포유동물 세포에서 발현시키는 방법; 상기 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 핵산 구조물로 코팅된 캐리어 입자를 포함하는, 입자-매개된 전달 디바이스로부터의 전달에 적합한 코팅된 입자; 상기 코팅된 입자를 포함하는 입자 매개된 전달 디바이스를 위한 투여 용기 (receptacle); 상기 코팅된 입자가 적재된 입자 매개된 전달 디바이스; 코딩 서열이 항원을 암호화하는 코팅된 입자의 유효량을 피검물에 투여하는 단계를 포함하는, 핵산 면역화 방법; (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열; (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부분의 엑손 2; 및 (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종 인트론을 포함하는 분리 정제된 키메릭 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 상기 및 기타 목적, 양상, 양태 및 이점이 본원의 기술에 비추어 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.