효모에서의 ＨＰＶ 58 Ｌ1의 최적화된 발현 document_id A220623042156

80가지를 초과하는 유형의 사람 파필로마바이러스(HPV)가 있으며, 이중 대다수는 양성 증식성 사마귀부터 악성 암종에 이르는 광범위한 생물학적 표현형과 연루되었다[참조: McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82(1):15-33(2001)]. HPV6 및 HPV11은 생식기 또는 호흡기 점막의 양성 사마귀, 비악성 첨형콘딜로마 및/또는 저등급 이형증과 가장 흔하게 연루되는 유형이다. HPV16 및 HPV18은 자궁경부, 질, 외음 및 항문관의 원위치(in situ) 및 침습성 암종과 가장 빈번하게 연루되는 고위험 유형이다. 90%를 초과하는 자궁경부 암종은 HPV16, HPV18 또는 덜 우세한 발암성 유형 HPV31, -33, -45, -52 및 -58의 감염과 연루된다[참조: Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85 (12): 958-64 (1993)]. HPV DNA가 90%를 초과하는 자궁경부 암에서 검출된다는 관찰결과는, HPV가 자궁경부 암종을 유발한다는 강력한 역학적 증거를 제공한다. 파필로마바이러스는 8개 이하의 초기 유전자(early gene)와 2개의 후기 유전자(late gene)를 암호화하는 소형의(50 내지 60nm) 비외피 20면체 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)은 E1 내지 E7, 및 L1 및 L2로 지정되어 있으며, 이때 "E"는 초기를 나타내고 "L"은 후기를 나타낸다. L1 및 L2는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 반면, E 유전자는 바이러스 복제 및 세포 형질전환과 같은 기능과 관련된다. L1 단백질은 주요 캡시드 단백질로서 분자량이 55 내지 60kDa이다. L2 단백질은 부수적 캡시드 단백질이다. 면역학적 데이타는, 대부분의 L2 단백질이 바이러스 캡시드내에서 L1 단백질보다 내부에 있음을 제시한다. L1 및 L2 단백질은 둘다 상이한 파필로마바이러스들 간에 고도로 보존되어 있다. 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세균 세포내에서 L1 단백질 또는 L1과 L2 단백질의 배합물의 발현은 바이러스-유사 입자(VLP)의 자가-어셈블리를 유도한다[참조: Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)]. VLP는 형태학적으로 진성 비리온(authentic virion)과 유사하며 동물 또는 사람에게 투여시 고역가의 중화 항체를 유도할 수 있다. VLP가 잠재적 발암성 바이러스 게놈을 함유하지 않기 때문에, VLP는 HPV 백신 개발에 있어 생 바이러스의 사용에 대한 안전한 대안책으로서 제시되고 있다[참조: Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)]. 이러한 이유로, L1 및 L2 유전자는 HPV 감염 및 질병의 예방 및 치료 백신의 개발을 위한 면역학적 표적으로서 동정되었다. HPV 백신 개발 및 상품화는 성공적으로 형질전환된 숙주 유기체에서 캡시드 단백질의 고발현 수준을 수득하는 것과 연관된 곤란함에 의해 방해되었는데, 이러한 곤란함은 정제된 단백질의 생산을 제한한다. 따라서, HPV58 L1 단백질과 같은 HPV L1 단백질을 암호화하는 야생형 뉴클레오타이드 서열의 동정에도 불구하고, 의도하는 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 HPV58 L1-암호화 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 용이하게 재생가능한 조(粗) HPV L1 단백질 공급원을 개발하는 것이 매우 요망된다. 또한, 백신 개발시 사용하기 위한 천연 단백질의 면역-부여 특성을 갖는 HPV58 L1 VLP를 대량으로 제조하는 것이 유용할 것이다. 발명의 개요 본 발명은 HPV58 L1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물에 대한 면역을 유도하거나 증진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 효모 세포에서의 고수준 발현을 위해 코돈-최적화된(codon-optimized), HPV58 L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 추가로 효모 세포에서 재조합 HPV58 L1 또는 L1 + L2를 발현시킴으로써 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공하며, HPV-관련 암의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물 및 백신에서의 HPV58 VLP의 용도를 개시한다. 본 발명은 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자에 관한 것이다. 상기 합성 분자의 코돈은, 효모 세포가 선호하는 코돈을 사용하도록 고안된다. 상기 합성 분자는 VLP로 자가-어셈블리될 수 있는 HPV58 L1 단백질 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 VLP는 VLP-기본 백신에서 사용될 수 있다. 본 발명의 예시적 양태는 서열번호 2에 제시한 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 효모 세포에서 높은 수준의 발현을 위해 최적화된 코돈인 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열(본원에서 "58 L1 R 서열"로 명칭됨)을 포함한다. 본 명세서 전반에 걸쳐서 기술되는 핵산 분자를 함유하는 원핵성 및 진핵성 재조합 벡터 및 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 본 발명은 또한 (a) HPV58 L1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, (a) 핵산 분자가 효모 숙주 세포에서의 최적 발현을 위해 코돈-최적화된, HPV58 L1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면의 바람직한 양태에서, 당해 핵산은 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 효모 세포에서 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP), HPV58 VLP의 제조 방법 및 HPV58 VLP의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 측면은 효모 세포에서 HPV58 L1 또는 HPV58 L1 + L2의 재조합 발현에 의해 생산되는 HPV58 VLP이다. 본 발명의 또 다른 측면은 코돈-최적화된 HPV58 L1 유전자에 의해 제조되는 HPV58 L1 단백질을 포함하는 HPV58 VLP이다. 본 발명의 상기 측면의 예시적 양태에서, 코돈 최적화된 HPV58 L1 유전자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 HPV58 바이러스-유사 입자를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, HPV58 VLP는 코돈-최적화된 유전자에 의해 생산된다. 본 발명의 또 다른 측면은 HPV58 VLP를 포함하는 백신을 포유동물에게 투여함을 포함하는, HPV-관련 자궁경부 암의 예방 또는 치료 방법이다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 양태에서, HPV58 VLP는 효모에서 생산된다. 본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명의 상기 측면의 대안적 양태에서, 당해 백신은 하나 이상의 추가 HPV 유형의 VLP를 또한 포함한다. 하나 이상의 추가 HPV 유형은 당해 분야에 기술되어 있는 임의의 HPV 유형 또는 후속적으로 동정될 유형을 포함하여 관심대상의 임의의 HPV 유형일 수 있다. 바람직한 양태에서, HPV 유형은 사마귀 또는 자궁경부 암과 같은 임상 표현형과 연루된 유형이다. 추가의 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가 HPV 유형은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV58 VLP 및 하나 이상의 추가 HPV 유형의 VLP를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가 HPV 유형은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 가산명사의 단수 형태가 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 다음 정의 및 약어가 적용된다: "프로모터"란 용어는 RNA 폴리머라제가 결합되는 DNA 쇄상의 인식 부위를 의미한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제와 개시 복합체를 형성하여 전사 활성을 개시하고 구동시킨다. 상기 복합체는 "인핸서(enhancer)" 또는 "상류 활성화(upstream activating) 서열"이라 명명된 활성화 서열 또는 "사일런서(silencer)"라 명명된 억제 서열에 의해 변형될 수 있다. "벡터"란 용어는 DNA 단편을 숙주 유기체 또는 숙주 조직으로 도입시킬 수 있는 몇가지 수단을 의미한다. 플라스미드, 바이러스(아데노바이러스 포함), 박테리오파아지 및 코스미드를 포함하는 다양한 종류의 벡터가 있다. "카세트"란 용어는 벡터로부터 발현될 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열, 예를 들어 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 나타낸다. 일반적으로, 카세트는 벡터내로 삽입된 유전자 서열을 포함하고, 이는, 몇몇 양태에서 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 발현하기 위한 조절 서열을 제공한다. 다른 양태에서, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 이의 발현을 위해 조절 서열을 제공한다. 추가의 양태에서, 벡터는 몇몇 조절 서열을 제공하고, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 다른 조절 서열을 제공한다. 예를 들면, 벡터는 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 전사하기 위한 프로모터를 제공할 수 있고, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 전사 종결 서열을 제공한다. 벡터에 의해 제공될 수 있는 조절 서열은 인핸서, 전사 종결 서열, 스플라이싱 수용체 및 공여체 서열, 인트론, 리보솜 결합 서열 및 폴리(A) 부가 서열을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. "58 L1 야생형 서열" 및 "58 L1 wt 서열"이란 명칭은 본원에서 서열번호 3으로서 개시된 HPV58 L1 서열을 의미한다. HPV58 L1 야생형 서열이 이전에 기술되었으나, 임상적 분리체로부터 수득된 DNA들 간에 근소한 서열 변이가 발견되는 것은 통상적이다. 따라서, 대표적 58 L1 야생형 서열은 이미 HPV58 DNA를 함유하는 것으로 보여진 임상 샘플로부터 분리되었다(실시예 1 참조). 본원에서 기술하는 코돈-최적화된 58 L1 서열들을 비교하기 위해 58 L1 야생형 서열을 참조 서열로서 사용하였다(도 1 참조). "HPV58 L1 R" 또는 "58 L1 R"이란 명칭은 본원에 기술된 예시적 합성 HPV58 L1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 의미하며, 이때 당해 서열은 고수준 발현을 위해 효모 세포가 선호하는 코돈을 포함하도록 재구성되었다. "유효량"이란 용어는 충분한 백신 조성물이 도입되어 면역반응이 야기되기에 적절한 수준의 폴리펩타이드를 생산함을 의미한다. 당해 분야의 숙련가는 상기 수준이 달라질 수 있음을 인지하고 있다. "보존적 아미노산 치환"이란 1개의 아미노산 잔기의 또 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 이러한 보존적 치환의 예로는 1개의 소수성 잔기(이소류신, 류신, 발린 또는 메티오닌)의 다른 잔기로의 치환; 1개의 극성 잔기의 동일한 전하의 다른 극성 잔기로의 치환(예를 들어, 아르기닌의 라이신으로의 치환; 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환)이 있다. "포유동물"이란 용어는 사람을 포함하는 모든 포유동물을 의미한다. "VLP" 또는 "VLP들"은 바이러스-유사 입자 또는 바이러스-유사 입자들을 의미한다. "합성"은, HPV58 L1 유전자가 지정된 천연 야생형 HPV58 L1 유전자(58 L1 wt, 서열번호 3)에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 생성되었음을 의미한다. 상기 언급한 바와 같이, 발현을 위해 효모 세포가 선호하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 합성 분자가 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 합성 분자는 야생형 HPV58 L1 유전자와 동일한 아미노산 서열(서열번호 2)을 암호화한다.