감마-카르복실화된 단백질의 제조 방법 document_id A220623042168

출혈은 일반적인 임상적 문제이다. 출혈은 질병, 외상, 수술 및 의료적 처치로 인하여 발생한다. 출혈을 물리적으로 차단하는 하는 일은 긴급한 일이다. 그러나 출혈의 위치로 인하여 또는 출혈은 수많은 (작은) 혈관으로부터 확산하여 발생하기 때문에 출혈의 차단은 쉽지 않은 일이거나 또는 심지어 불가능할 수도 있다. 따라서 출혈이 있는 환자는 지혈을 촉진하는 제제를 사용하여 처리할 필요가 있을 수 있다. 이 제제는 혈액 유래의 제품(혈액요법), 내인성 지혈제의 방출을 유발하는 제제, 재조합 응고 인자(F), 또는 응혈의 분해를 지연시키는 제제일 수 있다. 흔히 지역의 병원으로부터 입수되는 혈액 유래 제품 중에서도 1차적 치료제로는 용적 대체 및 지혈 촉진을 위한 전혈, 산소 수송능의 향상을 위한 포장된 적혈구, (혈소판의 수가 적거나 결함이 있다면) 혈소판의 수를 증가시키기 위한 혈소판 농축물 및 지혈(혈액 응고 및 혈소판 응집)의 촉진을 위한 신선한 냉동 혈장이 있다. 지혈을 촉진하는 2차적 혈장 유래 제품으로는 혈장 냉동침전물, 프로트롬빈 복합 농축물, 활성화된 프로트롬빈 복합 농축물 및 정제된 응고 인자가 있다. 몇 종의 응고 인자가 오늘날 인간 재조합 단백질, 불활성 응고 인자 VIII 및 IX 및 활성화 응고 인자 VIIa로서 시판되고 있다. 혈우병은 비정상 또는 결함성 응고 인자를 보유하거나 향응고 기능을 억제하는 응고 인자에 대해 생성된 항체를 보유하는 유전병 또는 후천성 출혈병이다. 가장 흔한 혈우병은 A형 혈우병(응고 인자 VIII 결함) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX 결함)이다. 정제된 또는 재조합 단일 응고 인자는 혈우병 환자의 주요 치료제이다. 억제성 항체를 보유한 환자는 그 항체가 이들 환자에게 투여된 응고 인자를 중화시킬 수도 있기 때문에 치료에 어려움을 부과한다. 단백질 C(APC)의 활성형은 활성화된 응고 인자 Va 및 VIIIa의 분해에 의한 혈장 응고의 억제제이다. 재조합 APC는 패혈증 환자에 나타나는 과도한 혈장 응고의 효과적인 치료제인 것으로 확인되었다. 치료용 응고 인자는 인간의 혈장으로부터 입수할 수도 있지만, 그 정제 과정이 간단하지 않고 여러 단계를 거쳐야 하는데, 그 중 몇 단계는 오염성 바이러스를 제거하기 위한 단계이다. 그러나 혈액 유래 제품의 철저한 안전성 기준 및 테스트에도 불구하고 감염성 바이러스 또는 프리온에 의한 오염은 배제할 수가 없다. 이러한 위험 요인으로 인하여, 동물 유래 성분이 함유되지 않은 배지에서 배양한 재조합 세포 유래의 치료용 인간 단백질을 제조할 것이 절실히 요구되고 있다. 다수의 단백질은 포유동물 숙주에 의해 완벽한 기능을 갖는 형태로 생성될 것, 즉 정확하게 번역후 변형될 것을 요하기 때문에 상기와 같은 단백질의 제조가 항상 수월한 일은 아니다. 재조합 세포에서 제조하여 시판되고 있는 응고 인자에는 FVII(NovoSeven), FVIII(Kogenate, Recombinate, Refacto) 및 FIX(BeneFix)(Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11:169-177, 1997) 및 활성 단백질 C(Xigris)가 있다. 완전한 기능을 갖는 재조합 인간 응고 인자를 다량으로 얻는 데 있어 주된 장애 요인 중 하나는 FII, FVII, FIX, FX 및 단백질 C에 존재하는 Gla-도메인에 있다. 이 도메인은 카르복실기의 추가에 의해 번역후 변형된 글루탐산 잔기를 포함한다. 이러한 인자들의 생산은, 이들의 과발현이 카르복실화 정도를 감소시키고 그로 인하여 불활성 단백질을 생성하게 된다는 점에서 장애가 되고 있다. Gla 변형은 γ-글루타밀 카르복실라제(γ-glutamyl carboxylase; GGCX)로 불리는 비타민 K 의존성 효소의 작용에 의한 것이다. 이 효소는 여러 과학자들, 특히 응고 인자 연구에 관여하는 과학자들에 의해 집중적으로 연구되었다(WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038):1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24):16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). 적어도 두 그룹의 연구진에 의해 GGCX와 응고 인자 FIX를 동시에 발현시킴으로써 수율을 증가시키고자 하는 시도가 이루진 바 있으나 성공하지 못하였다(Rehemtulla, et al. 1993, ibid Hallgren et al. 2002, ibid). γ-카르복실화 단백질의 중요성이 크다는 점을 고려하면, 훨씬 더 많은 동시 발현 시도가 행해졌으나 실패하였기 때문에 보고되지 않았음을 추측할 수 있다. 인간 FII(프로트롬빈)의 경우 완전한 기능의 프로트롬빈을 얻기 위해서는 10개의 Glu 잔기 중 적어도 8개가 정확하게 변형되어야 한다(Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers and Walz ''Prothrombin and other vitamin K proteins'', CRC Press, 1986). CHO 세포, BHK 세포, 293 세포 및 백시니아 바이러스 발현 시스템과 같은 몇 종의 상이한 시스템을 이용하여 높은 생산량의 rhFII를 얻고자 많은 노력이 기울여졌으나 모두 실패하였거나 아니면 카르복실화 정도가 낮은 생성물이 생성되어 기능적 불활성의 프로트롬빈이 생성되었다(Jorgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid Wu and Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). 그보다 전에는 카르복실화 재조합 인간 프로트롬빈에 대한 생산성이 낮은 것으로 보고되었는데, 즉, 돌연변이 프로트롬빈의 경우 20 mg/L(Cote et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), CHO 세포에서 발현된 인간 프로트롬빈의 경우 0.55 mg/L(완전 카르복실화, Jorgensen et al. 1987, ibid), CHO 세포에서는 25 mg/L(카르복실화 정도가 제시되지 않음, Russo et al. 1997, ibid)이었다. WO 92/19636은 인간 및 소의 비타민 K 의존성 카르복실라제의 클로닝 및 서열 확인 결과를 개시한다. 이 출원은 비타민 K 의존성 단백질을 제조하기 위해 비타민 K 의존성 카르복실라제와 비타민 K 의존성 단백질을 적절한 숙주 세포에서 동시에 발현시키는 방법을 제안한다. 그러나 카르복실라제와 비타민 K 의존성 단백질의 동시 발현이 예시되어 있지는 않다. 따라서, 활성화된 혈액 응고 인자를 고수율로 생산할 수 있는 개선된 방법이 요구되는 실정이다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하기 위한 방법을 제시한다. 발명의 개요 본 발명의 제1 측면에 따르면, 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되는데, 이때 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터는 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다. 본 발명의 제2 측면에 따르면, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 (ii) γ-글루타밀 카르복실라제를 발현하도록 조작된 세포가 제공되는데, 이때 상기 단백질 (i) 및 (ii)는 10:1～500:1의 비로 발현된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (i) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질을 코딩하고, 세포에 의한 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (ii) γ-글루타밀 카르복실라제 단백질에 의한 카르복실화를 요하는 단백질을 코딩하고, 상기 세포에 의한 상기 카르복실화를 요하는 단백질의 발현이 가능하도록 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드 를 포함하는 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포가 제공되는데, 이때 상기 세포는 γ-글루타밀 카르복실라제 단백질과 카르복실화를 요하는 단백질을 적어도 1:10의 비로 발현할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 감마-카르복실화를 요하는 단백질 및 제1 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자와, γ-글루타밀 카르복실라제 및 제2 프로모터를 포함하는 관련된 발현 조절 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공되는데, 이때 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제가 적어도 10:1의 비로 발현되도록 상기 제1 프로모터가 상기 제2 프로모터보다 충분히 더 강력하다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 감마-카르복실화 단백질의 제조 방법이 제공되는데, 이 방법은, (i) 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 적어도 10:1의 비로 발현하도록 조작된 세포를 상기 두 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 인자 IX를 제조하는 데 이용되며, 다른 구체예에서 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 프로트롬빈을 제조하는 데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 제조된 감마-카르복실화 단백질은 인간 감마-카르복실화 인자 X이다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물 세포주에서 감마-카르복실화 단백질을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 포유동물 세포주에서의 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 동시에 발현시키는 단계로서, 감마-카르복실화를 요하는 단백질의 발현량이 γ-글루타밀 카르복실라제의 발현량보다 10배 이상 더 많은 것인 단계; 및 (ii) 감마-카르복실화 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 인자 IX의 제조에 이용되며, 다른 구체예에서 이 방법은 감마-카르복실화된 인간 프로트롬빈을 제조하는 데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 제조된 감마-카르복실화 단백질은 인간 감마-카르복실화 인자 X이다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질 및 상기 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질을 응고 치료에 사용하는 용도 또는 상기 방법에 따라 제조된 분리된 감마-카르복실화 단백질을 응고 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하는 용도가 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 혈액 응고를 유도하거나 응고 증가 또는 응고 감소를 촉진하는 데 적합한 약학 조성물의 제조 방법 및 이 방법으로부터 얻을 수 있는 약학 조성물이 제공되는데, 상기 방법은 감마-카르복실화를 요하는 단백질과 γ-글루타밀 카르복실라제를 10:1～500:1의 비로 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 발현된 활성형 카르복실화 단백질을 정제하는 단계; 및 정제된 카르복실화 단백질을 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 활성형 카르복실화 단백질은 감마-카르복실화 인간 인자 IX이며, 또 다른 구체예에서 활성형 카르복실화 단백질은 감마-카르복실화 인간 프로트롬빈이다. 또 다른 구체예에서, 활성형 카르복실화 단백질은 감마-카르복실화 인자 X이다.