심근 세포의 증식 방법 document_id A220623042212

성체의 심근 세포는 세포 분열 기능이 상실된 상태이므로, 허혈이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 심근 세포가 괴사 및 상실되더라도 심근 세포는 보충되지 않는다. 그 결과, 남아있는 심근 세포는 대상성 비대에 의해 심장 기능을 유지하려고 하지만, 그 상태가 지속되어 심근 조직의 허용 범위를 넘어서게 되면 새로운 심근 세포의 피폐 및 사멸을 유발하여, 최종적으로는 심근 기능의 저하, 즉 심부전으로 발전된다. 심부전을 비롯한 심장병은, 일본에서 사망 원인의 2위를 차지하고 있다. 또한, 심장병 환자의 예후도 지극히 나빠, 5년 생존율은 50% 정도에 불과하다. 따라서, 치료 효과가 높은 심부전 치료법의 개발이 의료복지 및 의료 경제적 관점에서 매우 유익하다고 생각할 수 있다. 지금까지 심부전 치료제로, 심근의 수축력을 증가시키는 디기탈리스 제제나 크산틴 제제 등의 강심제가 사용되어 왔으나, 이들 약제를 장기간 투여하는 경우 오히려 병의 용태를 악화시키는 경우도 있는 것이 알려져 있다. 또한, 최근에는 β 차단제나 ACE 저해제 등, 교감 신경계나 레닌-안지오텐신계의 항진에 의한 과잉 심부하를 경감시키는 약제에 의한 치료가 주를 이루고 있지만, 이는 대증적 치료법에 불과하여, 상해를 입은 심장 조직 자체를 회복시키는 것은 아니다. 한편, 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 기증자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적, 경제적 부담 등의 문제가 있어, 일반적인 치료법으로 심장이식 방법을 사용하기는 어려운 실정이다. 최근에는, 손상된 심장 조직에 심근 세포를 보충적으로 이식하는 방법도 검토되고 있다. 동물을 이용한 실험에서, 태아로부터 회수한 심근 세포를 성체 심장조직에 이식하면 이식된 세포는 심근 세포로서 유효하게 기능하는 것으로 알려져 있다(예, 비특허문헌 1 참조). 또한, 배아 줄기세포(ES 세포)인 심근 세포를 포함한 각종 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 다능성 세포로부터 심근 세포로 제조하여, 이를 이식용 세포로서 이용하는 연구도 진행되고 있다. 그러나, 이러한 방법은 윤리적인 관점에서 임상 의료에 응용하기 어려운 측면이 있다. 또한, 최근에는 골수 유래 줄기세포를 이식하여, 상기 줄기세포를 심장 조직내 심근 세포로 분화시키는 방법이 시도되고 있으나, 분화 효율이 매우 낮고, 심근 세포를 재생 및 보충하는 방법으로는 비실용적인 측면이 있다(예, 비특허문헌 2, 3, 4 등 참조). 본 발명의 발명자들은 심근 세포의 세포 주기 조절 기구, 특히 사이클린-사이클린 의존적 키나아제(CDK) 시스템의 역할을 연구한 결과, 심근 세포에서는 혈청이나 증식 인자 등의 증식 자극에 의해 D형 사이클린 및 CDK4의 발현이 유도되지만, 이들 단백질 분자는 세포질에 국한되어 핵내로 이동하지 않으므로, 사이클린 D - CDK4의 핵내 표적분자인 RB 단백질의 인산화 및 사이클린 E - CDK2의 활성화가 이루어지지 않는다는 사실을 확인하였다. 또한, 사이클린 D1에 핵 국재성 시그널(nucleus localizing signal: NLS)을 부가한 유전자(이하, D1NLS)와 CDK4을 코딩하는 유전자를 삽입한 아데노바이러스 벡터를 제작하고 이를 배양한 심근 세포에 감염시킨 경우, 사이클린 D1 단백질과 CDK4 단백질이 핵내에 발현되어 RB의 인산화를 통하여 심근 세포의 증식 및 분열을 유발한다는 것을 확인하였다. 이로써, 통상의 배양 조건에서는 거의 증식(유사분열)하지 않는 심근 세포의 증식을 성공시켰다. 또한, D1NLS 및 CDK4 유전자를 동물 성체의 심근 조직에 도입 및 발현시킴으로써, 동물 성체의 심근 세포의 세포 주기를 진행시키는 것도 성공하였다(예, 특허문헌 1, 비특허문헌 5 참조). 이하, 해당 발명에 의해 심근 세포를 증식시키는 방법을 DNLS/CDK법이라고 한다. 또한, 상기의 특허문헌 1 및 비특허문헌 5에 기재되어 있는 다른 문헌의 모든 개시 내용은, 본 출원 명세서에도 포함되는 것으로 한다. 심근 세포의 세포 주기를 진행시키고, 세포 분열을 유도하고자 하는 시도는 그 외에도 많이 행해져 왔다(이하, 심근 세포의 세포 주기 진행에 관한 총설로서, 예컨대, 비특허문헌 6 참조). 예를 들면, 랫 신생아에서 회수한 배양 심근 세포에, 아데노바이러스 유래의 E1A/E1B 유전자(비특허문헌 7)나 E2F 유전자(비특허문헌 8 참조)을 발현시키면, 심근 세포의 DNA 합성이 유도되는 것으로 보고되고 있다. 또한, 핵 국재성 시그널을 가지지 않는 통상형의 사이클린 D1 유전자를 과잉 발현하는 형질전환 마우스에서도, 심근 세포에서의 CDK4 발현 수준 상승과 함께 DNA 합성의 유도가 확인되었다(예, 비특허문헌 9 참조). 또한, 최근에는 사이클린 D1 유전자의 발현을 억제하는 jumonji 유전자가 결손된 마우스 태아 심근 세포의 세포 증식 정지기가 연장되는 것으로 관찰되었다(예, 비특허문헌 10 참조). 이와 같이, 심근 세포에서도 DNA 합성 유도 및 세포 주기 진행이 가능한 것으로 확인되고 있지만, 상기의 실험예에서는 심근 세포가 세포자살로 유도되거나, 비정상적인 다핵 세포가 출현하는 경우가 많으며, 출생 이후에 심근 세포의 세포 분열을 촉진시켜 실제 세포수를 증가시키는 방법은, DNLS/CDK법 이외에는 전무한 실정이다. 이와 같이, DNLS/CDK법은 통상적으로 "증가하지 않는다"는 심근 세포를 증가시킬 수 있는 획기적인 방법이며, 산업상 이용 가치도 높다. 일반 진핵세포도, 복수개의 정(正) 및 부(負)의 조절 인자가 세포 주기의 진행을 조절하는 것으로 알려져 있다. 정(正)의 조절 인자로는 전술한 각종 사이클린 및 CDK이 있으며, 부(負)의 조절 인자로는 CDK 저해 인자인 일련의 단백질 군을 들 수 있으며, 작용 양상이 상이한 2개의 CDK 저해 인자 패밀리가 동정되어 있다(예, 비특허문헌 11 참조). 제1 패밀리는 Ink4 패밀리 단백질이라고도 하며, p16(Ink4A, Mts1, Cdkn2 및 Cdkn4i로도 알려져 있음), p15(Ink4B 및 Mts2로도 알려져 있음), p18(Ink4C 및 Ink6A로도 알려져 있음) 및 p19(p20, Ink4D 및 Ink6B로도 알려져 있음)가 있으며, CDK4 또는 CDK6와 선택적으로 결합하여 사이클린D-CDK4(또는 CDK6) 복합체의 기능을 저해한다(예, 비특허문헌 12, 13, 14 참조). CDK 저해 단백질의 제2 패밀리는, Cip/Kip 패밀리 단백질이라고도 하며, p21(Cip1, PiCl, Sdi1, mda6 및 Waf1으로도 알려져 있음; 이하, p21Cip1), p27(Ick, Kip1 및 Pic2로도 알려져 있음; 이하, p27Kip1), 및 p57(Kip2로도 알려져 있음; 이하, p57Kip2)가 있으며, Ink4 패밀리와는 달리 다양한 사이클린-CDK 복합체의 기능을 저해함으로써, 세포 주기의 진행을 저해하는 것으로 밝혀지고 있다(예, 비특허문헌 15, 16, 17, 18 참조). 심근 세포의 증식 억제에서 이들 CDK 저해 단백질이 관여하는 방식에 대하여, Cip/Kip 패밀리 단백질에 관한 몇 개의 보고가 있다. 즉, 태생 후기부터 생후에 심근 세포의 증식 능력이 저하됨에 따라, p21Cip1단백질이나 p27Kip1 단백질의 발현량이 증가되고 상기 단백질의 표적 분자인 CDK2이나 CDK4의 활성화가 저하된다(예, 비특허문헌 19 참조). 또한, E2F-1 유전자를 과잉 발현시킨 심근 세포에 IGF-1(insulin-like growth factor-1)을 첨가하면, p21Cip1 단백질이나 p27Kip1 단백질의 발현량이 감소하고, 이에 수반하여 DNA 합성기(S기)의 심근 세포 비율이 증가한다(예, 비특허문헌 20 참조). 또한, p27Kip1 유전자 결손 마우스에서는 통상의 마우스보다 심근 세포의 증식 정지 시기가 지연되어, 심근 세포의 수 증가가 보고되어 있다(예, 비특허문헌 21 참조). 이와 같이, Cip/Kip 패밀리 단백질, 특히 p27Kip1이 심근 세포의 증식 억제에 관여할 가능성이 시사되고 있지만, 상기의 유전자를 결손시키는 방법 이외에, Cip/Kip 패밀리 단백질의 발현 및 작용을 억제하여 심근 세포를 분열 및 증식시키는 예는 전무한 상태이다. Cip/Kip 패밀리 단백질의 세포내 발현 수준은, 주로 유비퀴틴 경로를 통한 분해 시스템에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(예, 비특허문헌 22, 23, 24 참조). 유비퀴틴은 진화적으로 매우 보존된 76개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 모든 진핵세포내에 풍부하게 존재하고 있다. 유비퀴틴 경로에서 폴리유비퀴틴 사슬이 표적 기질과 공유결합한 후 다기능성 프로테아좀 복합체에 의해 분해시킨다. 이러한 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해되는 단백질로는, Cip/Kip 패밀리 단백질 이외에도 사이클린, p53, p300, E2F, STAT-1, c-Myc, c-Jun, EGF 수용체, IκBα, NFκB 및 β-카테닌등으로, 다방면에 걸쳐있다. 단백질 분자의 유비퀴틴화 메커니즘에 관하여 연구가 활발히 진행되고 있으며, 일반적으로, 일련의 효소군, 즉, 유비퀴틴 활성화 효소(E1), 유비퀴틴 복합화 효소(E2) 및 유비퀴틴 리가제(E3)의 작용에 의해 유비퀴틴 수식을 받은 단백질 분자는, 최종적으로 26S 프로테아좀에 의해 분해된다(예, 비특허문헌 25, 26, 27, 28 등 참조). 이 중, 특정한 표적 단백질을 유비퀴틴화하기 위한 특이성에 관여하고 있는 것으로 유비퀴틴 리가제(E3)가 추정되어 있으며, APC/C(Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) 복합체, VHL(von Hippel-Lindau protein-elongin B/C (VBC)) 복합체, Nedd4, Ufd4, Rad5, Rad18, Parkin 등, 수많은 예가 알려져 있다. 근래, 효모 등의 하등 생물에 대한 연구를 통해서, SCF라는 복합체로 구성되는 새로운 타입의 유비퀴틴 리가제가 동정되었다. 상기 SCF 복합체 타입의 유비퀴틴 리가제(이하, 유비퀴틴 리가제 SCF 복합체로 기재함)는, Skp1, Cul1(이명, Cdc53),및 F-박스(F-box)단백질이라는 3개의 서브유닛으로 구성되는 3량체 단백질이고, 명칭은 이들의 첫 글자를 취하여 SCF라 칭하고 있다(예, 비특허문헌 29, 30 참조 등). SCF 복합체의 구성 인자중 하나인 F-박스 단백질은, 사이클린 F에서 최초에 동정된 F-박스 모티프를 포함하며, 상기 모티프 영역은 Skp1과의 상호작용에 필요하다. 또한, F-박스 단백질은 그 외에도 WD-40 반복부라고 하는 40개 정도의 아미노산서열의 반복 모티프 영역 또는 루신이 풍부한 루신 리치 반복부(leucine-rich repeat)인 모티프 영역을 가지고 있다. SCF 복합체의 Skp1 및 Cul1/Cdc53은 어떠한 표적 기질에 대하서도 일정하지만, F-박스 단백질은 유비퀴틴화의 대상이 되는 표적 기질에 따라 그 분자종이 달라, WD-40 반복부 또는 루신 리치 반복부가 표적 기질을 인식 및 결합함으로써, SCF 복합체의 기질 특이성을 결정한다(예, 비특허문헌 31, 32, 33 참조). 이와 같이, SCF 복합체는 구성 인자로서 포함되는 F-박스 단백질의 차이에 따라, SCFβTrCP, SCFCdc4, SCFMet30, SCFGrr1 등의 복수 개로 존재하고 있다(예, 비특허문헌 29, 30 참조). Cip/Kip 패밀리 단백질의 유비퀴틴-프로테아좀 분해에는, F-박스 단백질로 Skp2을 포함하는 SCF복합체(SCFskp2)가 관여하고 있는 것으로 알려져 있다(예, 비특허문헌 34, 35, 36, 37 참조). Skp2는 당초 사이클린A-CDK2 복합체에 결합하는 인자로서 동정되었으며, 일반적인 증식 세포에서 세포 주기의 G1 후기에서부터 축적되어 S기(DNA 합성기)부터 G2기에 걸쳐 발현량이 최대가 되므로, S기 키나아제 회합 단백질(S-phase kinase-associated protein)이라고도 한다(예, 비특허문헌 38 참조). 또한, Skp2는 Cip/Kip 패밀리 단백질 이외에도, E2F-1(비특허문헌 39 참조)이나 사이클린E(비특허문헌 40 참조), CDK9(비특허문헌 41 참조), c-Myc(비특허문헌 42, 43 참조) 등의 단백질들도 표적 기질로 인식하여 분해에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 이와 같이, Cip/Kip 패밀리 단백질을 비롯한 CDK 저해 인자가 일반적인 증식성 세포의 증식 억제에 관여하고 있으며, 세포내 발현량 조절은 SCFSkp2 복합체를 통하여 유비퀴틴-프로테아좀 시스템이 담당하고 있다는 것이 알려져 있다. 그러나, 심근 세포의 증식 제어 메커니즘에서, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템이 어떻게 관여하고 있는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 전술한 DNLS/CDK법은 현재 유일하게 알려져 있는 심근 세포의 증식 방법이며, 매우 유용하고 산업상 이용 가치도 높다. 그러나, 심근재생 치료의 실용화 및 산업화의 가능성을 더욱 증대시키기 위해서는, 심근 세포의 증식 효과 및 효율을 한단계 더 발전시킬 필요가 있다. 특허문헌 1: 국제 공개 제 02/095026호 팜플렛 비특허문헌 1: Soonpaa 등, Science 264:98,(1994) 비특허문헌 2: Murry 등, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 67:519, (2002) 비특허문헌 3: Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75:S20(2003) 비특허문헌 4: Nir 등, Cardiovasc. Res. 58:313(2003) 비특허문헌 5: Tamamori-Adachi 등, Circ. 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