ＨＢＶ 변이체 검출 및 응용 document_id A220623042215

선행 기술의 설명 본 명세서에 언급된 문헌의 상세한 목록은 명세서 마지막 부분에 일괄 기술하였다. 명세서에 언급된 선행 기술은 어떤 국가에서나 통상의 일반적인 지식의 일부를 이루는 인식이나 임의의 제안 형태가 아니고, 그렇게 간주되어서도 안된다. B형 간염 바이러스(HBV)는 쇠약 질병 증상을 야기하여 급성 간기능 부전을 초래할 수 있다. HBV는 RNA 중간체를 통해 복제되고 그의 복제 전략에서 역전사를 이용하는 DNA 바이러스이다(Summers and Mason, Cell 29: 403-415, 1982). HBV 게놈은 표면, 코어, 폴리머라제 및 X 유전자를 코딩하는 오버래핑 ORF(overlapping open reading frame)를 갖는 부분 이중나선 DNA 구조의 복잡한 성질을 소유한다. 복잡한 성질의 HBV 게놈을 도 1에 나타내었다. 폴리머라제는 네개의 기능 영역인 말단 단백질(TP), 스페이서, 역전사효소(rt) 및 리보뉴클레아제(RNAse)로 구성된다. HBV의 폴리머라제 유전자가 외피(envelope) 유전자에 오버래핑되고, 폴리머라제 유전자의 촉매 도메인에서 돌연변이가 또한 외피 단백질의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있거나, 반대 현상이 일어날 수 있다. 특히, HBsAg 내에서 발견되고 아미노산 99와 169 사이에 위치한, 'a' 결정인자로 알려진 HBV의 중화 도메인 유전자 서열은 실질적으로 바이러스 폴리머라제 단백질의 주요 촉매 영역, 및 특히 도메인 A 및 B위에 오버래핑된다. HBV DNA 폴리머라제의 존재로 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체가 효과적인 항바이러스 제제로 작용할 수 있다고 제안하기에 이르렀다. 현재 시험중인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 예로서 펜시클로비르 및 그의 경구형(FCV)[Vere Hodge, Antiviral Chem Chemother 4: 67-84, 1993; Boyd et al., Antiviral Chem Chemother. 32: 358-363, 1987; Kruger et al., Hepatology 22. 219A, 1994; Main et al., J. Viral Hepatitis 3: 211-215, 1996], 라미부딘[(-)-β-2'-데옥시-3'-티아사이티딘]; (3TC 또는 LMV)[Severini et al., Antimicrobial Agents Chemother. 39: 430-435, 1995; Dienstag et al., New England J Med 333: 1657-1661, 1995]이 있다. 이미 임상 실험에 진입한 새로운 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 피리미딘 엠트리시타빈, ((-)-β-L-2'-3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아사이디딘; FTC), 3TC의 5-플루오로 유도체, 및 클레부딘(1-(2-플루오로-5-메틸-β-L-아라비노-푸라노실)우라실; L-FMAU), 티미딘 유사체를 포함한다. 3TC와 마찬가지로, 이들은 비천연 "L"-배열을 갖는 피리미딘 유도체이다. 수개의 퓨린 유도체가 또한 임상 실험중에 있으며, 이들은 엔테카비르(BMS-200, 475; ETV), 카보사이클릭 데옥시구아노신 유사체, 디아미노퓨린 디옥솔란(DAPD), 디옥솔란 구아닌((-)-β-D-2-아미노퓨린 디옥솔란; DXG)의 경구 프로드럭 및 아데포비르 디피복실, 비환식 데옥시아데노신 모노포스페이트 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 아데포비르(9-[포스포닐메톡시에틸]아데닌; PMEA)의 경구 프로드럭을 포함한다. 예비 임상 및 임상 시험중인 다른 약제에는 FLG[메디비르], ACH-126, 443(L-d4C)[Archillion Pharmaceuticals], ICN 2001-3(ICN) 및 라시비르(RCV) [Pharmassett]가 포함된다. 이들 제제는 HBV DNA 합성을 저해하는데 매우 효과적이기는 하지만, 장기 항바이러스 화학요법동안 HBV의 내성 돌연변이체가 출현할 위험이 있다. 장기간 LMV 치료를 받고 있는 환자에서 주 내성 돌연변이는 폴리머라제내 rt 도메인 rtM204I/V+/-rtL180M 뿐 아니라 다른 돌연변이에서 선택된다. 폴리머라제 돌연변이에 사용된 명명은 Stuyver 등에 의한 상기 문헌(2001)에 제안된 바에 따른다. LMV는 만성 HBV 감염에 사용되도록 승인된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체이다. LMV는 HBV 복제의 특히 효능있는 저해제이며, 바이러스 DNA 합성을 저해하여 동소 간이식(OLT)후, 만성 감염 환자의 혈청에서 HBV DNA 역가를 감소시킨다. LMV 단일요법은 장기간 HBV 복제를 조절할 것으로 보이지 않는다. 이는 단일요법동안 HBV의 LMV-내성 균주의 출현을 거의 피할 수 없기 때문이다. 아데포비르 디피복실(ADV: 이전에, bis-pom PMEA)은 비환식 데옥시아데노신 모노포스페이트 유사체 아데포비르(이전에, PMEA)의 경구적으로 허용되는 프로드럭이다(도 2). ADV는 또한 HBV 복제의 효능있는 저해제이며, 최근 만성 HBV 감염에 사용되도록 FDA에서 승인을 받았다. 아데포비르 디피복실은 뉴클레오티드(vs. 뉴클레오시드) 유사체이고 그 자체로 약물 활성화동안 제 1 포스포릴화 반응을 바이패스한다는 점에서 이 계통의 다른 제제와 다르다. 이 단계는 종종 속도-제한적이다. 아데포비르 디피복실은 HBV의 야생형 및 라미부딘-내성 균주에 대한 임상 활성이 입증되었으며, 현재 III 상 임상 시험중이다(Gilson et al., J Viral Hepat 6: 387-395, 1999; Perrillo et al., Hepatology 32: 129-134, 2000; Peters et al., Transplantation 68: 1912-1914, 1999; Benhamou et al., Lancet 358: 718-723, 2001). II 상 조사중에, 30 mg의 아데포비르 디피복실을 매일 투여한 결과 12 주간 바이러스혈증이 평균 4 log10으로 감소되었다(Heathcote et al., Hepatology 28: A620, 1998). ADV는 치환된 비환식 뉴클레오시드 포스포네이트이다. 이 계통의 화합물에는 또한 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(테노포비르 DF, 또는 테노포비르, 또는(TFV) 또는 9-R-(2-포스포노메톡시프로필)아데닌(PMPA)으로도 지칭되며, Gilead sciences에 의해 Viread로 시판되고 있다)가 포함된다. TFV는 HBV 및 HIV 둘다에 대해 항바이러스 활성을 나타낸다(Ying et al., J Viral Hepat. 7(2): 161-165, 2000; Ying et al., J. Viral Hepat. 7(1): 79-83, 2000; Suo et al., J Biol Chem. 273(42): 27250-27258. 1998). FTC는 HBV 및 HIV에 대해 활성을 나타낸다(Frick et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 2285-2292, 1993). 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 요법은 단일요법 또는 병용 요법으로 투여될 수 있으며, 병용 요법에서는 2 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체가 투여될 수 있다. 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 또한 인터페론 또는 B형 간염 면역글로불린(HBIG)과 같은 다른 항바이러스 제제와 함께 투여될 수 있다. HBV의 뉴클레오시드/뉴클레오티드-유사체- 또는 항체-내성 균주의 출현을 모니터링하고 이들 내성 바이러스를 검출하기 위한 진단 프로토콜을 개발하고/하거나 이들을 사용하여 항바이러스 제제로 유용한 성질을 갖는 제제를 스크리닝하고/하거나 개발하거나 설계하는 것이 요망된다. 이들 내성 균주의 결함 형태 또는 그로부터의 항원 성분은 또한 바이러스 표면 성분에 대한 항체이기 때문에 치료 백신 조성물을 개발하는데 유용한 것으로 제안되었다. 발명의 개요 본 명세서를 통해 달리 언급되지 않으면, 용어 "포함하다", 또는 "포함하는" 등의 변형어는 지정된 원소 또는 정수, 또는 원소 또는 정수의 그룹을 포함하며 임의의 다른 원소 또는 정수, 또는 원소 또는 정수의 그룹을 제외시키지 않음을 함축하는 것으로 이해하여야 할 것이다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 식별 번호(SEQ ID NO:)로 언급된다. SEQ ID NOs:는 서열 식별 003c#400003e# 1(SEQ ID NO: 1), 003c#400003e# 2(SEQ ID NO: 2) 등에 수치적으로 상응한다. 서열 식별을 표 1에 요약하여 나타내었다. 서열 목록이 청구범위 다음에 주어진다. 본 원에서는 아미노산 서열에서의 특이적인 돌연변이를 "XaalnXaa2"로 나타내었으며, 여기에서 Xaal은 돌연변이전의 원래 아미노산 잔기이며, n은 잔기 번호이고, Xaa2는 돌연변이체 아미노산이다. 약어 "Xaa"는 세 문자 또는 단일 문자(즉 "X") 코드일 수 있다. "XaalnXaa2" 앞의 "rt"는 "역전사효소"를 의미한다. "s"는 외피 유전자를 의미한다. HBV DNA 폴리머라제에 대한 아미노산 잔기의 경우 모티브 Tyr Met Asp Asp(YMDD)에서 메티오닌 잔기는 잔기 번호 204로 넘버링된다(Stuyver et al., Hepatology 33: 751-757, 2001). B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 아미노산 잔기는 Norder 등에 따라 넘버링된다(J. Gen. Virol. 74: 341-1348, 1993). 단일 및 세 문자 약어는 아미노산 잔기를 정의하기 위하여 사용되며, 표 2에 요약하여 나타내었다. 본 발명에 따라, ADV로 치료된 만성 HBV 감염 환자(환자 A 내지 L)에서 선택할 HBV 변이체가 동정되었다. 환자 E는 ADV에 무반응자이다. ADV 및 LMV의 병용 치료, TFV 및 LMV의 병용 치료(예: 환자 M) 또는 TFV 및 FTC의 병용 치료 또는 TFV의 단독 치료중에 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 HBV의 감수성을 감소시키는 HBV DNA 폴리머라제 유전자의 돌연변이와 함께 HBV의 다른 변이체가 동정되었다. 따라서, HBV rt 변이체는 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제(anti-HBV agent) 또는 이들의 조합물에 대해 내성이거나 감수성이 감소된 것으로 고려된다. 표면 항원에서 상응하는 돌연변이가 또한 일어난다. 이들 HBV 변이체의 동정은 ADV, LMV, FTC 및/또는 TFV 내성 및/또는 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대한 내성을 모니터링하고 대안의 치료제로서 유용한 제제를 스크리닝하는데 중요하다. 본 원에 사용된 "항 HBV 제제"는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 뿐만 아니라 면역 시약(예: HBV 표면 성분에 대한 항체), 및 바이러스 복제, 유지, 감염, 어셈블리 또는 방출을 저해하거나 방해하는 화학 제제, 단백질 제제 및 핵산 제제를 포함한다. 이러한 HBV 변이체의 검출은 HBV 감염을 치료하는데 적절한 제제를 선택하는 것을 비롯하여 치료 프로토콜을 관리하는데 특히 중요하다. 이러한 측면에 따른 본 발명의 방법은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들 조합물의 존재하에 HBV 적재(load)가 증가된 대상에서 진행상황을 모니터링하는 것에 부분적으로 기초하고 있다. 이어서, 임상가는 기존의 치료 프로토콜을 변형하거나 적절한 치료 프로토콜을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자에 상기 DNA 폴리머라제에 대해 1 이상의 아미노산 첨가, 치환 및/또는 결실을 야기하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고, ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 및 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 항 HBV 제제에 대해 감수성이 감소된 분리된 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체에 관한 것이다. 변이체 HBV는 HBV DNA 폴리머라제의 도메인 F 및 G, 및 도메인 A 내지 E 중 1 이상에 의해 한정된 영역 게놈에서 오버래핑 ORF의 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 다른 측면은 S 유전자에 표면 항원에 대해 1 이상의 아미노산 첨가, 치환 및/또는 결실을 야기하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고, ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 및 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 항 HBV 제제에 대해 감수성이 감소된 분리된 HBV 변이체를 제공한다. rt 영역에 유용한 돌연변이체는 일례로 rtT38K, rtR55H 및 rtA181V를 포함하고; 다른 예로 rtS/T78S, rtV80L, rtN/S118N, rtN/K139K, rtE142V, rtA/T181A rtI204M, rtQ/P/S/Stop215S, rtE/K218E, rtN/H238H 및 rtY245H를 포함하며; 또 다른 예로 rtN238T를 포함하고; 다른 예로 rtI122V 및 rtA181T를 포함하며; 또 다른 예로 rtL180M, rtA/V200V, rtM204V, rtV214A, rtH237H/P, rtV253G를 포함하고, 또 다른 예로 rtT128N 및 rtN236T를 포함하며, 또 다른 예로 tL180M, rtM204V rtQ215S를 포함하고, 또 다른 예로 rtT128S rtL180M, rtM204V 및 rtQ215S를 포함하며, 또 다른 예로 rtI80L, rtI204M, rtN238T를 포함하고, 또 다른 예로 rtN238T/A를 포함하며, 또 다른 예로 rtI187V를 포함하고, 또 다른 예로 rtN123N/I rtS135Y, rtV214A/V 및 rtQ215Q/P/Stop/S를 포함하거나, 이들의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다. 다른 HBV 변이체는 또한 돌연변이 rtT38K(DNA 폴리머라제의 F 도메인), rtR55H(F와 A 도메인 사이에 위치), rtS/T78S, rtV80L(이들은 A 도메인내에 위치한다), rtN/S118N, rtI122V, rtN123N/I, rtS135Y, rtN/K139K, rtE142V(A와 B 도메인 사이에 위치), rtA181V, rtA181T(이들은 B 도메인에 위치한다); rtI187V(B와 C 도메인 사이에 위치), rtA/V200V(C 도메인에 위치), rtV214A, rtV214A/V 및 rtQ215Q/P/Stop/S, rtQ/P/S/Stop215S, rtQ215S, rt E/K218E(C와 D 도메인 사이에 위치), rtn236T, rtH237H/P rtN/H238H, rtN238T, rtN238T/A(이들은 D 도메인에 위치한다), rtY245H(D와 E 도메인 사이에 위치) 및 rtV253G(E 도메인에 위치), 또는 이들의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다. S 유전자에 유용한 돌연변이는 일례로 Q30K, sE44G, sA47T, sI126T, sA159V 및 sL173F를 포함하고, 다른 예로 sF55S, sC/Stop69C, sC/Y76Y, sI/V110I, sN/T131N, sN134Y, sStop/W172W, sStop/W196W, sS/R207R를 포함하며; 또 다른 예로 sV14A, sL95W, sV96G 및 sI208T/I를 포함하고; 또 다른 예로 sT47A 및 sWl72stop를 포함하고, 또 다른 예로 PreS2 T6S, sT47A, sP62L, sL/F192F, sI195M를 포함하고, 또 다른 예로 sS53L를 포함하고, 또 다른 예로 sP120T를 포함하고, 또 다른 예로 sN40S, sS207R를 포함하고, 또 다른 예로 sQl0lR, sI195M, sS207R를 포함하고, 또 다른 예로 sL95W 및 sL196W를 포함하고, 또 다른 예로 sV14A를 포함하고, 또 다른 예로 sL42R, sQ102Q/R, sT115T/S, sS207S/R, sL215R 및 sL216Stop를 포함하거나, 이들의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 또한 HBV로부터 DNA 또는 상응하는 mRNA를 분리하는 단계, 및 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대해 내성 또는 감소된 감수성을 수반하고, DNA 폴리머라제의 도메인 F 및 G 및 도메인 A 내지 E 중 임의의 1 이상 또는 이들에 인접한 영역에서 1 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 야기하는 돌연변이를 HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, HBV가 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타낼지의 가능성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 돌연변이의 존재는 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대한 내성의 가능성을 제시한다. 본 발명은 또한 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV, ADV 및 LMV 및 FTC 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대해 내성이 있는 변이체 HBV 또는 변이체 HBV 유래의 HBV 표면 항원 또는 이들의 재조합체 또는 유도체 형태 또는 그의 화학적 등가물 및 1 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일면은 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자에 DNA 폴리머라제에 대해 1 이상의 아미노산 첨가, 치환 및/또는 결실을 야기하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고, ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대해 감수성이 감소된 상기 언급된 조성물 또는 변이체 HBV의 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방용 약제를 제조하기 위한 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 HBV로부터 DNA 또는 상응하는 mRNA를 분리하는 단계, 및 DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 돌연변이를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, HBV 균주가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 감소된 감수성을 나타낼지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 rt 영역에서 하기 돌연변이의 존재는 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대해 감수성이 감소된 변이체를 제시한다: 일례로 rtT38K, rtR55H 및 rtA181V를 포함하고; 다른 예로 rtS/T78S, rtV80L, rtN/S118N, rtN/K139K, rtE142V, rtA/T181A rtI204M, rtQ/P/S/Stop215S, rtE/K218E, rtN/H238H 및 rtY245H를 포함하고; 또 다른 예로 rtN238T를 포함하고; 또 다른 예로 rtI122V 및 rtA181T를 포함하고; 또 다른 예로 rtL180M, rtA/V200V, rtM204V, rtV214A, rtH237H/P, rtV253G를 포함하고, 또 다른 예로 rtT128N 및 rtN236T를 포함하고, 또 다른 예로 tL180M, rtM204V rtQ215S를 포함하고, 또 다른 예로 rtT128S rtL180M, rtM204V 및 rtQ215S를 포함하고, 또 다른 예로 rtI80L, rtI204M, rtN238T를 포함하고, 또 다른 예로 rtN238T/A를 포함하고, 또 다른 예로 rtI187V를 포함하고, 또 다른 예로 rtN123N/I rtS135Y, rtV214A/V 및 rtQ215Q/P/Stop/S를 포함하거나, 또는 이들의 조합물 또는 등가물의 1 이상의 다른 돌연변이를 포함한다. 다른 방법은 외피 유전자(들)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 돌연변이를 스크리닝하는 과정을 포함하며, 여기에서 s 유전자에서 하기 돌연변이의 존재는 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; 및/또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV, 및/또는 임의로 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이들의 조합물에 대해 감수성이 감소된 변이체를 제시한다: 일례로 sQ30K, sE44G, sA47T, sI126T, sA159V 및 sL173F를 포함하고, 다른 예로 sF55S, sC/Stop69C, sC/Y76Y, sVV110I, sN/T131N, sN134Y, sStop/W172W, sStop/W196W, sS/R207R을 포함하고; 또 다른 예로 sV14A, sL95W, sV96G 및 sI208T/I를 포함하고; 또 다른 예로 sT47A 및 sW172stop를 포함하고, 또 다른 예로 PreS2 T6S, sT47A, sP62L, sL/F192F, sI195M을 포함하고, 또 다른 예로 sS53L을 포함하고, 또 다른 예로 sP120T를 포함하고, 또 다른 예로 sN40S, sS207R을 포함하고, 다른 예로 sQl0IR, sI195M, sS207R을 포함하고, 또 다른 예로 sL95W 및 sL196W를 포함하고, 또 다른 예로 sV14A를 포함하고, 또 다른 예로 sL42R, sQ102Q/R, sT115T/S, sS207S/R, sL215R 및 sL216Stop를 포함하거나, 또는 이들의 조합물 또는 등가의 1 이상의 다른 돌연변이를 포함한다. 바람직하게, 변이체는 1 이상의 정제 단계를 거쳐 자연적으로 발생한 체액을 제거한 분리된 형태이다. 또한, 변이체는 분리된 체액에서 유지될 수 있거나, DNA 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 변이체 HBV 유래의 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 감염 분자 클론에 관한 것이다. 세포, 세포 용해물, 배양 상등액 및 체액에서 HBV 또는 그의 성분의 검출은 임의 핵산-기초 검출 수단, 예를 들어 핵산 하이브리드화 기술 또는 1 이상의 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 포함하여 편리한 수단에 의해 행해질 수 있다. 용어 "체액"은 혈액, 림프, 조직, 또는 혈청, 전혈, 생검 및 생검액, 기관 체외이식편 및 간 현탁액과 같은 기관 현탁액을 비롯한 기관 시스템으로부터 유래된 임의의 유체일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 기준 또는 야생형 HBV 유래의 표면 항원에 비해 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 변이체 HBV에 관한 것으로, 여기에서 기준 또는 야생형 표면 항원에 발생된 항체는 HBV 변이체에 대해 변경된 면역 프로파일을 나타낸다. 변경 프로파일중 하나는 HBV의 중화력 감소이다. 보다 특히, 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV에 비해 변경된 면역 프로파일을 나타내며, 여기에서 변이체 HBV는 HBV DNA 폴리머라제의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 선택된다. 이와 같은 측면의 본 발명의 변이체 HBV는 또한 치료전 HBV에 비해 단일 또는 다수의 뉴클레오티드 치환, 첨가 및/또는 결실을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체 조합물에 노출된 대상으로부터 HBV를 분리하는 단계, 분리한 HBV를 표면 항원에 대한 1 이상의 항체 패널과 접촉시키는 단계, 및 결합 친화성 또는 결합 스펙트럼에서의 임의의 변화를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 면역 프로파일이 변경된 변이체 HBV를 검출하는 방법을 제공한다. 관련 발명으로, 본 발명은 ADV, LMV, TFV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 노출된 대상으로부터 혈청 샘플을 분리하는 단계, 분리한 혈청 샘플을 HBV 표면 항원 또는 그의 항체-결합 단편 패널과 접촉시키는 단계, 및 결합 친화성 또는 결합 스펙트럼에서의 임의의 변화를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 면역 프로파일이 변경된 변이체 HBV를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 분리된 HBsAg 또는 그의 재조합체 형태 또는 유도체 또는 변이체 HBV에 상응하는 그의 화학적 등가물에 관한 것이다. 일반적으로, HBsAg 또는 그의 재조합체 또는 유도체 형태 또는 그의 화학적 등가물은 기준 HBV 유래의 HBsAg에 비해 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실 또는 절단을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 기준 HBV에 대한 항체는 HBV를 갖는 상기 변이체 HBsAg에 대해 변경된 면역 프로파일을 나타낸다. 일례로, 변경된 면역 프로파일은 변이체 HBV의 중화능 감소를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 플라스미드 벡터에 함유된 HBV 유래의 복제 가능(replication competent)-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성하고, 세포를 상기 작제물로 형질감염시키는 단계, 형질감염전, 형질감염중 및/또는 형질감염후에 세포를 시험하고자 하는 제제와 접촉시키는 단계, 상기 제제에 내성을 나타내는 경우, HBV가 복제하고, 유전자 서열을 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 어셈블링하고/하거나 방출하기에 충분한 시간 및 조건하에서 상기 세포를 배양한 다음, 세포, 세포 용해물 또는 배양 상등액을 바이러스- 또는 바이러스 성분-검출 수단에 적용하여, 바이러스가 제제의 존재하에 복제되고, 유전자 물질을 발현하고/하거나 어셈블링되고/되거나 방출되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, HBV에 대해 저해 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예로, 바큘로바이러스 벡터내 플라스미드 벡터 및 방법은 세포를 감염시키기에 효과적인 양의 바큘로바이러스 게놈에 함유되거나 융합된 HBV 유래의 복제 가능-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성하고, 세포를 상기 작제물로 감염시키는 단계, 감염전, 감염중 및/또는 감염후에 세포를 시험하고자 하는 제제와 접촉시키는 단계, 상기 제제에 내성을 나타내는 경우, HBV가 복제하고, 유전자 서열을 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 어셈블링하고/하거나 방출하기에 충분한 시간 및 조건하에서 상기 세포를 배양한 다음, 세포, 세포 용해물 또는 배양 상등액을 바이러스- 또는 바이러스 성분-검출 수단에 적용하여, 바이러스가 제제의 존재하에 복제되고, 유전자 물질을 발현하고/하거나 어셈블링되고/되거나 방출되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이들 방법과 관련하여, 플라스미드 벡터는 바큘로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 다른 바이러스 벡터의 일부 또는 전부를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(참조: Ren and Nassal, J. Virol. 75(3): 1104-1116, 2001). 다른 구체예로, 방법은 감염 HBV 게놈이 2.2.15 또는 AD 세포주가 예시되나 이로만 한정되지 않는 연속계대 세포주에 안정하게 통합되도록 복제 가능 유효량으로 HBV 게놈의 감염 카피를 포함하는 연속계대 세포주를 생성하고, 세포를 시험하고자 하는 제제와 접촉시킨 후, 상기 제제에 내성을 나타내는 경우, HBV가 복제하고, 유전자 서열을 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 어셈블링하고/하거나 방출하기에 충분한 시간 및 조건하에서 상기 세포를 배양한 다음, 세포, 세포 용해물 또는 배양 상등액을 바이러스- 또는 바이러스 성분-검출 수단에 적용하여, 바이러스가 제제의 존재하에 복제되고, 유전자 물질을 발현하고/하거나, 어셈블링되고/되거나 방출되었는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 다른 구체예로, 본 발명은 또한 시험관내 폴리머라제 분석에서 HBV 폴리머라제에 저해 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 확립된 분석을 이용하여 HBV 폴리머라제 활성을 조사할 수 있다(Gaillard et al., Antimicrob Agents Chemother. 46(4): 1005-1013, 2002; Xiong et al., Hepatology. 28(6): 1669-73, 1998). HBV 폴리머라제는 야생형 또는 기준 HBV 폴리머라제 또는 돌연변이체 HBV 폴리머라제일 수 있다. 바이러스 변이체의 동정은 L, M, S 단백질을 코딩하는 폴리머라제 또는 외피 유전자 PreSl, PreS2, S와 같은 특정 재조합체 바이러스 성분을 포함하는 백신 뿐만 아니라 결실 HBV 변이체를 포함하는 치료 백신의 생산을 가능하게 한다. L, M, S 단백질을 코딩하는 폴리머라제 또는 외피 유전자 PreS 1, PreS2, S 또는 HBV의 다른 성분과 상호작용할 수 있는 치료 분자를 동정하거나 생성하기 위하여 합리적 약물 설계가 또한 이용될 수 있다. 이러한 약물은 또한 진단 가능성을 가질 수 있다. 그외에, 결실 HBV 변이체는 또한 동일, 유사 또는 동종 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하기 위한 치료 조성물로 사용될 수 있다. 또한, HBV 변이체 또는 그의 표면 성분에 생성된 항체는 HBV 변이체 또는 유사 또는 동종 바이러스에 의한 감염으로부터 대상을 수동 면역화시키기 위해 사용될 수 있다. 추가로, HBV 성분의 활성을 하향조절하고, 복제, 유지, 감염, 어셈블리 또는 방출을 저해할 수 있는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, RNAi 또는 siRNA 분자(둘 다 DNA-유래 또는 합성), 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드, 화학 또는 단백질성 분자와 같은 제제가 본 발명에 의해 제공된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 약어들을 표 3에 요약하여 나타내었다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 서열을 표 1에 요약하여 나타내었다. 표 1 서열 식별자 요약 표 2 단일 및 세 문자 아미노산 약어 표 3 약어