개선된 단백질 발현 시스템 document_id A220623042216

상업적인 중요성 측면에서, 단백질 기재의 치료제를 제조하는데 있어서 박테리아 세포의 사용이 늘어나고 있다. 박테리아 발현 시스템을 개발하는 목표들 중 하나는 고품질의 표적 폴리펩티드를 빠르고, 효율적이며, 풍부하게 제조하는 것이다. 이러한 발현 시스템을 위한 이상적인 숙주 세포는 표적 폴리펩티드의 제조를 위한 탄소 공급원을 효율적으로 이용할 수 있고, 발효 반응에서 높은 세포 밀도로 빠르게 성장할 수 있고, 유도되는 경우에만 표적 폴리펩티드를 발현할 수 있으며, 조절 및 환경적 문제가 없는 배지 상에서 성장할 수 있다. 우수한 숙주 세포를 생성시키는데 있어서 많은 장애가 있다. 첫째, 재조합 폴리펩티드를 제조하기 위해서는, 표적 단백질을 코딩하는 발현 벡터가 숙주 세포 내에 삽입되어야 한다. 다수의 박테리아는 발현 벡터가 숙주로부터 제거되는 경우인 형질전환되지 않은 상태로 복귀될 수 있다. 이러한 복귀변이체(revertant)는 원하는 재조합 폴리펩티드를 제조하는데 있어서 발효 효율을 저하시킬 수 있다. 표적 펩티드를 코딩하는 발현 벡터는 전형적으로 벡터 내에 선별 마커를 포함한다. 흔히, 선별 마커는 유전자로서 그의 생성물은 발효 과정 동안 생존을 위해 필요하다. 선별 마커가 없는 숙주 세포, 예를 들면 복귀변이체는 생존할 수 없다. 발효 과정 동안 선별 마커의 사용은, 발현 벡터를 함유하는 박테리아만이 생존하여 복귀변이체와 형질전환체 사이의 경쟁을 없애고 발효 효율을 저하시키기 위한 것이다. 가장 통상적으로 사용되는 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 숙주 세포는, 선택된 항생제 내성 유전자 생성물에 의해 분해될 수 있는 항생제가 보충된 배지 중에서 성장한다. 항생제 내성 유전자를 갖는 발현 벡터를 함유하지 않는 세포는 항생제에 의해 사멸된다. 전형적인 항생제 내성 유전자로는 테트라사이클린, 네오마이신, 카나마이신 및 암피실린 유전자를 들 수 있다. 그러나, 박테리아 숙주 세포 중 항생제 내성 유전자의 존재는 환경, 조절 및 상업적 문제들을 야기한다. 예를 들어, 항생제 내성 유전자-함유 생성물 (및 항생제 내성 유전자의 사용에 의해 제조된 생성물)은 환경, 인간 및 동물 건강에 있어서의 생물학적 안전성에 대해 잠재적인 위험이 되는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 문헌 ([M. Droge et al., Horizontal Gene Transfer as a Biosafety issue: A natural phenomenon of public concern, J. Biotechnology. 64(1):75-90 (17 Sept. 1998)]; [Gallagher, D. M., and D. P. Sinn. 1983. Penicillin-induced anaphylaxis in a patient under hypotensive anaesthesia. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 56:361-364]; [Jorro, G., C. Morales, J. V. Braso, and A. Pelaez. 1996. Anaphylaxis to erythromycin. Ann. Allergy Asthma Immunol. 77:456-458]; [F. Gebhard 0026# K. Smalla, Transformation of Acinetobacter sp. strain BD413 by transgenic sugar beet DNA, Appl. 0026# Environ. Microbiol. 64(4):1550-54 (Apr. 1998)]; [T. Hoffmann et al., Foreign DNA Sequences are received by a wild type strain of Aspergillus niger after co-culture with transgenic higher plants, Curr. Genet. 27(1):70-76 (Dec. 1994)]; [DK Mercer et al., Fate of free DNA and transformation of the oral bacterium Streptococcus gordonoii DL1 by plasmid DNA in Human saliva, Appl. 0026# Environ. Microbiol. 65(1):6-10 (Jan 1999)]; [R. Schubbert et al., Foreign (M13) DNA ingested by mice reaches peripheral leukocytes, spleen, and liver via the intestinal wall mucosa and can be covalently linked to mouse DNA, PNAS USA 94:961-66 (Feb. 4, 1997)]; 및 [AA Salyers, Gene transfer in the mammalian intestinal tract, Curr. Opin. in Biotechnol. 4(3):294-98 (Jun 1993)])을 참조한다. 이러한 문제로 인해, 수많은 정부의 식품, 약물, 보건 및 환경 관리 기관, 및 수많은 최종 소비자들은 항생제 내성 유전자 핵산이 시판되는 유기체로부터 제거되었거나 또는 상기 유기체에 존재하지 않는 것을 원한다. 또한, 관리 제거를 확실히 하기 위해서는 최종 생성물로부터 선별 항생제가 제거되었음을 입증하는 증거가 제공되어야 한다. 영국, 캐나다, 프랑스, 유럽 사회 및 미국은 모두 식품, 동물 사료, 약물, 및 재조합 약물 제조를 비롯한 약물 제조에 있어서 항생제 내성 유전자의 사용을 검토해 왔다. 이러한 작용제의 제거, 특히 이러한 제거를 입증하는 것은 비용이 많이 들고, 시간 소모적이며, 흔히 미미한 효과만 있을 뿐이다. 재조합 폴리펩티드의 제조에서 선별을 위해 항생제 내성 유전자를 사용하는데 있어서의 고유한 문제로 인해, 대안적 선별 방법들이 연구되어 왔다. 영양요구성 선별 마커 영양요구성 선별 마커는 일부 시스템들에서 항생제 선별에 대한 대안으로서 사용되어 왔다. 예를 들어, 영양요구성 마커는 효모에서 널리 사용되어 왔는데, 그 이유는 주로 항생제 내성 선별 마커가 상기 숙주 세포에서 비효율적이었기 때문이다. 예를 들어, 문헌 ([JT Pronk, (2002) "Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research," App. 0026# Envirn. Micro. 68(5):2095-2100]; [Boeke et al., (1984) "A positive selection for mutants lacking orotodine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast; 5-fluoro-orotic acid resistance," Mol. Gen. Genet. 197:345-346]; [Botstein 0026# Davis, (1982) "Principles and practice of recombinant DNA research with yeast," p.607-636, in JN Strathern, EW Jones. And JR Broach (ed.), The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae, Metabolism and gene expression, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]; [Cost 0026# Boeke, (1996) "A useful colony color phenotype associated with the yeast selectable/counter selectable marker MET15," Yeast 12:939-941])을 참조한다. 그러나, 효모 발현 시스템은 박테리아 시스템이 제공하는, 표적 단백질의 제조를 위한 잠재적인 속도 및 효율을 제공하지 않는다. 또한, 박테리아에서의 영양요구성 마커 선별은 선행 문헌들에 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,920,048호, 동 제5,691,185호, 동 제6,291,245호, 동 제6,413,768호, 동 제6,752,994호, 문헌 ([Struhl et al. (1976) PNAS USA 73; 1471-1475]; [MacCormick, C. A., et al., (1995) "Construction of a food-grade host/vector system for Lactococcus lactis based on the lactose operon," FEMS Microbiol. Lett. 127:105-109]; [Dickely et al. (1995), "Isolation of Lactococcus lactis nonsense suppressors and construction of a food-grade cloning vector," Mol. Microbiol. 15:839-847]; [Soerensen et al., (2000) "A food-grade cloning system for industrial strains of Lactococcus lactis," Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258]; [Fiedler 0026# Skerra, (2001) "proBA complementation of an auxotrophic E. coil strain improves plasmid stability and expression yield during fermenter production of a recombinant antibody fragment," Gene 274:111-118])을 참조한다. 선행 문헌에 기술된 상업적 규모의 박테리아 발효 시스템에 있어서 영양요구성 선별 마커의 사용은 이들의 사용을 제한하는 결점을 갖는다. 주요한 결점은, 미국 특허 제6,413,768호에 언급되어 있는 바와 같이, 영양물 영양요구성 선별 마커 시스템이 일반적으로 교차 섭취(cross feeding)로 어려움을 겪는다는 것이다. 교차 섭취라는 용어는 특정 대사산물에 대해 영양요구성인 제1 세포가 이 대사산물의 부재하에서, 상기 세포의 환경으로부터 상기 대사산물을 공급받음으로써 생존하는 능력, 및 전형적으로는 상기 세포가 영양요구성인 배지로부터 상기 대사산물의 배출된 중간체, 대사산물 자체, 또는 배지에 없는 상기 대사산물에 대해 원영양성인, 제2 세포에 의해 제조된 원영양성 부여 분자를 이용하여 상기 대사산물을 공급받음으로써 생존하는 능력을 지칭한다. 또한, 문헌 ([GR Barker et al., Biochem. J. 157(1):221-27 (1976) (cross feeding of thymine in E. coli)]; [TJ Kerr 0026# GJ Tritz, J. Bact. 115(3):982-86 (Sep. 1973)(cross feeding of NAD in E. coli auxotrophic for NAD synthesis)]; [GA Sprenger et al., FEMS Microbiol. Lett. 37(3):299-304 (1986) (selection of nalidixic acid to avoid the cross feeding problem)])을 참조한다. 교차 섭취에 의해 복귀변이체 박테리아가 생존할 수 있기 때문에, 교차 섭취는 발효 과정의 전체적인 능력을 저하시킴으로써, 표적 단백질을 제조하는 숙주 세포가 더 적게 존재함으로 인해 원하는 생성물을 최대의 효율적인 수준으로 제조한다. 발현 벡터 조절 이상적인 숙주 세포를 생성시키는데 있어서 다른 장애는 발효 과정에서 표적 폴리펩티드가 비효율적으로 낮은 수준으로 제조되는 것이다. 최적의 숙주 세포 밀도 및 발효 조건에 이를 때까지 표적 단백질의 발현을 조절함으로써 폴리펩티드를 보다 효율적으로 더 많이 얻을 수 있다. 이에 대한 이유로는 특정 탄소 공급원의 더 효과적인 이용 및 숙주 세포에 대한 광범위한 대사적 스트레스의 감소를 비롯하여 여러 가지가 있다. 그러나, 많은 경우에서, 세포 성장 동안 표적 단백질의 발현 억제는 불완전할 수 있으며, 특정 유도 단계에 앞서 상당한 양의 발현을 초래한다. 이러한 "누출성(leaky)" 억제는 숙주 세포 스트레스, 정상 세포 성장을 트랜스진으로 전환시키는 대사 에너지로 인한 탄소 공급원의 비효과적인 이용, 및 최적의 세포 밀도 유도점에 도달하는데 있어서의 지연을 초래함으로써 발효 수행 시간 및 비용의 증가 및 흔히 표적 단백질의 수율 감소를 초래한다. 따라서, 본 발명의 목적은 표적 단백질의 제조를 위한 개선된 발현 시스템을 제공하는 것이며, 여기서 제조는 효율적이고, 조절가능하며, 조절 및 환경적 문제를 최소화하는 배지 중에서 수행된다. 본 발명의 다른 목적은 표적 단백질의 제조를 위한 개선된 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용되는 유기체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 표적 단백질의 개선된 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 표적 단백질의 제조를 위한 개선된 발현 시스템에 사용되는 신규 구조물 및 핵산을 제공하는 것이다. 발명의 개요 본 발명에 이르러, 숙주 세포로서 비-항생제 내성의 영양요구성 선별이 가능하고(하거나) lacI 유전자 또는 유도체의 염색체 삽입물을 함유하는 슈도모나드 유기체를 선택함으로써 박테리아 단백질 제조를 개선시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 이러한 목적에는 슈도모나드 유기체인 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)가 특히 충분히 적합한 것으로 밝혀졌다. 이를 위해, 놀랍게도, 재조합 폴리펩티드가 높은 세포 밀도로 발효되는 동안 슈도모나스 플루오레센스는 영양요구성 선별하에 불리한 교차 섭취 억제를 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견에 의해, 재조합 폴리펩티드를 높은 수준으로 효율적으로 제조하는데 있어서 영양요구성 슈도모나스 플루오레센스를 숙주 세포로 사용할 수 있게 됨으로써, 항생제 내성 선별 마커의 사용과 관련된 고유한 결점 및 다른 박테리아 발현 시스템에 존재하는 영양요구성 교차 섭취의 문제를 극복할 수 있게 되었다. 또한, 놀랍게도, 슈도모나드에서 전체 또는 말단절단형(truncated) Plac-lacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌 LacI-코딩 유전자의 사용은 놀랍게도 유도 전 재조합 단백질 발현의 억제를 실질적으로 개선시키고, 상업적 규모의 발효에서 더 높은 세포 밀도를 나타내고, 선행 기술에 교시된 lacI-lacZYA 슈도모나드 염색체 삽입 (미국 특허 제5,169,760호)에 비해 원하는 생성물을 더 높은 수율로 얻는 것으로 밝혀졌다. 이러한 lacI 삽입은 슈도모나스 플루오레센스에서 LacI 리프레서 단백질을 코딩하는 다중-카피 플라스미드로서 Plac-Ptac 족 프로모터-조절된 트랜스진을 억제함으로써, 세포에서 LacI 리프레서 단백질을 코딩하는 별도의 플라스미드를 유지해야 할 필요성을 제외시키고, 이러한 유지에 의해 유발된 잠재적인 제조 비효율성을 감소시키는데 효과적이다. 또한, 이중 lac 작동유전자 서열의 사용은 슈도모나스 플루오레센스에서 유도에 앞서, 후속 유도 수율에서의 부수적인 감소 없이 재조합 단백질 발현을 우수하게 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 단백질의 개선된 제조에서 숙주 세포로서 사용되는 슈도모나드 유기체가 제공된다. 한 실시양태에서, 슈도모나드 유기체를 유전적으로 변형시켜 영양요구성을 유도하였다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 유기체는 슈도모나스 플루오레센스이다. 한 실시양태에서, 영양요구성은 하나 이상의 질소 함유 염기 화합물 생합성 유전자 또는 하나 이상의 아미노산 생합성 유전자에 대한 유전적 변형의 결과이다. 추가의 실시양태에서, 유전적 변형은 우라실 생합성 경로, 티미딘 생합성 경로 또는 프롤린 생합성 경로에서 활성인 효소를 코딩하는 유전자에 대한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 유전적 변형은 오로티딘(orotidine)-5'-포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 pyrF 유전자, 티미딜레이트 신타제를 코딩하는 thyA 유전자 또는 Δ1-피롤린-5-카르복실레이트 환원효소를 코딩하는 proC 유전자에 대한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 전체 또는 말단절단형 Plac-lacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌 게놈에 삽입된 LacI-코딩 유전자의 1개 이상의 카피를 제공하도록 유전적으로 변형된 슈도모나드 유기체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 한 실시양태에서, 슈도모나드는 LacI 리프레서 단백질을 코딩하는 천연 이. 콜라이 lacI 유전자를 함유한다. 다른 실시양태에서, 슈도모나드 세포는 lacIQ 유전자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 슈도모나드 세포는 lacIQ1 유전자를 함유한다. 다른 실시양태에서, 트랜스진 발현의 억제에 관여하는 하나 이상의 lac0 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 핵산 구조물을 포함하는 슈도모나드 유기체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 한 실시양태에서, 핵산 구조물은 1개 초과의 lac0 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 하나 이상, 바람직하게는 1개 초과의 lacOid 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 구조물은 Plac 족 프로모터의 3'에 위치하는 lac0 서열 또는 그의 유도체 및 Plac 족 프로모터의 5'에 위치하는 lac0 서열 또는 그의 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, lac0 유도체는 lacOid 서열이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 영양요구성을 유도하도록 유전적으로 변형되고 전체 또는 말단절단형 Plac-lacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌 천연 이. 콜라이 lacI 유전자, lacIQ 유전자 또는 lacIQ1 유전자의 염색체 삽입물을 함유하도록 추가로 변형된 슈도모나드 유기체를 제공한다. 다른 실시양태에서, 슈도모나드 유기체는 트랜스진 발현의 억제에 관여하는 하나 이상의 lac0 서열을 포함하는 핵산 구조물을 함유하도록 추가로 변형된다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 유기체는 슈도모나스 플루오레센스이다. 본 발명의 다른 측면에서, 단백질의 개선된 제조에 사용되는 핵산 서열이 제공된다. 한 실시양태에서, 영양요구성 슈도모나드 숙주 세포에 사용되는 원영양성 (prototrophy)-복구 효소를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 특정 실시양태에서, 유기체 슈도모나스 플루오레센스로부터 정제된 질소 함유 염기 화합물 생합성 효소를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스에서 pyrF 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다 (서열 1 및 3). 다른 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스에서 thyA 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다 (서열 4). 또 다른 실시양태에서, 유기체 슈도모나스 플루오레센스로부터 정제된 아미노산 생합성 화합물을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 특정 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스에서 proC 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다 (서열 6 및 8). 다른 측면에서, 본 발명은 신규 핵산의 발현 생성물인 신규 아미노산 서열을 제조한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 펩티드의 개선된 제조에 사용되는 핵산 구조물이 제공된다. 한 실시양태에서, a) 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 b) 원영양성-부여 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 슈도모나드 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용되는 핵산 구조물이 제공된다. 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 c) Plac-Ptac 족 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 d) lac 또는 tac 족 프로모터의 3'에서 하나 이상의 lac0 서열 또는 유도체를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 e) lac 또는 tac 족 프로모터의 5'에서 하나 이상의 lac0 서열 또는 유도체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 유도체 lacO 서열은 lacOid 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 유기체는 슈도모나스 플루오레센스이다. 본 발명의 한 실시양태에서, a) 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, b) Plac-Ptac 족 프로모터, c) lac 또는 tac 족 프로모터의 3'에서 하나 이상의 lac0 서열 또는 유도체, d) lac 또는 tac 족 프로모터의 5'에서 하나 이상의 lacO 서열 또는 유도체를 포함하는 슈도모나드 유기체에서 발현 벡터로서 사용되는 핵산 구조물이 제공된다. 한 실시양태에서, 유도체 lac0 서열은 lacOid 서열일 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 구조물은 e) 영양요구성 슈도모나드 세포에서 사용되는 원영양성-부여 선별 마커를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 유기체는 슈도모나스 플루오레센스이다. 본 발명의 다른 측면에서, 단백질의 개선된 제조에 사용되는 변형된 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, i) 재조합 폴리펩티드, 및 ii) 원영양성-부여 핵산을 포함하는 핵산 구조물을 갖는 영양요구성 슈도모나드 세포가 제공된다. 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 iii) Plac-Ptac 족 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 iv) 1개 초과의 lac0 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 슈도모나드는 영양요구성 슈도모나스 플루오레센스 세포이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 전체 또는 말단절단형 Plac-lacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌 천연 이. 콜라이 lacI 유전자, lacIQ 유전자 또는 lacIQ1 유전자의 염색체 삽입물을 함유하도록 추가로 유전적으로 변형된, 슈도모나스 플루오레센스를 비롯한 영양요구성 슈도모나드 유기체를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 염색체에 삽입된, 전체 또는 말단절단형 Plac-lacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌 lacI 트랜스진 또는 그의 유도체, 및 b) i) 재조합 폴리펩티드 및 ii) Plac-Ptac 족 프로모터를 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 슈도모나드 세포가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구조물은 iii) 하나 이상의 lac0 서열, 및 바람직하게는, 1개 초과의 lac0 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, lac0 서열은 lacOid 서열이다. 한 실시양태에서, 슈도모나드를 추가로 변형시켜 영양요구성을 유도하였다. 한 실시양태에서, 슈도모나드 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 본 발명의 한 측면에서, 개선된 단백질 제조에 사용되는, 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 a) 재조합 폴리펩티드, 및 b) 하나 이상의 대사산물에 대해 영양요구성인 슈도모나드에서 원영양성-복구 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 구조물의 발현을 제공한다. 대안적 실시양태에서, 슈도모나드는 1개 초과의 대사산물에 대해 영양요구성이다. 한 실시양태에서, 슈도모나드는 슈도모나스 플루오레센스 세포이다. 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 대사산물에 대해, 또는 질소 함유 염기 화합물 및 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사산물 조합에 대해 영양요구성인 슈도모나드에서 발현된다. 추가의 특정 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 우라실, 프롤린 및 티미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사산물에 대해 영양요구성인 슈도모나드에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 영양요구성은 각각 숙주 pyrF, proC 또는 thyA 유전자의 녹아웃(knock-out)에 의해 생성될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 PlacI-IacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌 천연 이. 콜라이 lacI 유전자, lacIQ 유전자 또는 lacIQ1 유전자의 숙주 세포의 염색체로의 삽입을 통해 유전적으로 변형된 영양요구성 슈도모나드 세포에서 발현된다. 하나의 특정 실시양태에서, 영양요구주에서 발현되는 재조합 폴리펩티드를 함유하는 벡터는 하나 이상의 lacOid 작동유전자 서열을 포함한다. 하나의 특정 실시양태에서, 영양요구성 숙주 세포에서 발현된 재조합 폴리펩티드를 함유하는 벡터는 둘 이상의 lac 작동유전자 서열 또는 그의 유도체를 포함한다. 다른 추가의 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 Plac 족 프로모터에 의해 유도된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은, lacI 코딩 유전자가 PlacI-lacI-lacZYA 오페론의 일부가 아닌, 슈도모나드 숙주 세포의 게놈으로 삽입된 LacI 코딩 유전자의 하나 이상의 카피를 제공하도록 유전적으로 변형된 슈도모나드 숙주 세포의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, Lac 리프레서 단백질을 코딩하는 유전자는 천연 이. 콜라이 lacI 유전자의 것과 동일하다. 다른 실시양태에서, Lac 리프레서 단백질을 코딩하는 유전자는 lacIQ 유전자이다. 또 다른 실시양태에서, Lac 리프레서 단백질을 코딩하는 유전자는 lacIQ1 유전자이다. 특정 실시양태에서, 슈도모나드 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 다른 실시양태에서, 슈도모나드를 추가로 유전적으로 변형시켜 영양요구성 세포를 생성시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 재조합 폴리펩티드를 적어도 약 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L 또는 적어도 약 10 g/L의 수준으로 제조한다. 다른 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 3 g/L 내지 100 g/L의 수준으로 발현된다.