모나틴 및 모나틴 전구체의 생산 document_id A220623042217

인돌-3-피루베이트는 조직내에서 산화성 스트레스를 고농도의 산소로 길항 작용시키는 것으로 알려진 강력한 항산화제이다. (Politi et al. "Recent advances in Tryptophan Research", edited by G. A. Filippini et al. Plenum Press, New York, 1996, pp 291-8). 또한, 인돌 피루베이트는 1차 식물 성장 호르몬 옥신 (확산성 성장 촉진 인자)인 인돌-아세트산 (IAA)를 생산하는 경로에서 중간체가 된다. IAA는 정부 우세, 향성, 새싹 신장, 층 분열의 유도 및 뿌리 분화를 비롯한 다양한 생리학적 과정에서의 서브마이크로그램 함량으로 활성을 띤다. 합성 옥신은 원예학에서 발근을 유도하고 과실의 형성 및 성장을 촉진하는데 사용된다. 미국 특허 제5,843,782호 및 제5,952,231호 참조. 합성 옥신은 고농도에서는 잎이 넓은 식물에 대한 제초제로서 효과적이다. 발효에 의하여 생성된 천연 옥신은 화학적으로 생성된 제초제에 비하여 환경 친화성이 더 큰 것으로 간주될 수 있다. 성장 조절제는 전세계적으로 1999년에 4억 파운드 (14억 US 달러) 정도 시판되었다. 식물 관련 용도 이외에, 인돌 아세트산은 약학적 적용예에서 유용하다. 예를 들면, 미국 특허 제5,173,497호에는 예컨대 알츠하이머 질환 및 노인성 치매와 관련된 기억력 손상의 치료에서의 이들 화합물의 용도가 제안되어 있다. 미국 특허 제5,173,497호에서 제안된 기전은 이들 화합물이 아세틸콜린에스테라제를 억제하고, 뇌에서의 아세틸콜린의 농도를 증가시키는 것이다. 인돌-3-카르비놀은 퍼옥시다제-촉매화 산화 반응에 의하여 인돌-3-아세트산으로부터 생성되며, 디인돌릴메탄으로 용이하게 전환될 수 있다. 이들 두 화합물은 독소를 제거하며 여성의 건강에 이로운 호르몬의 생산을 촉진하는 것으로 보고되었다. 염소화 D-트립토판은 인공 무영양 감미료로서 알려졌으며, 기타의 유도체를 모색하고자 하는 지속적인 관심이 존재하고 있다. 모나틴 [2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-아미노글루타르산]은 조성에 있어서 아미노산 트립토판과 유사한 천연 감미료이다. 이는 남아프리카공화국산 떨기나무인 쉴러로치톤 일리시폴리우스(Sclerochiton ilicifolius)의 뿌리의 수피로부터 추출되며, 이는 고강도 감미료로서 식품 및 음료 산업에서 유망하다. 모나틴에 대한 특허 문헌의 몇몇의 예로는 미국 특허 제5,994,559호, 제4,975,298호, 제5,128,164호 및 제5,128,482호 등이 있다. 개요 본 발명은 모나틴 [2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-아미노글루타르산 - 또한, 4-아미노-2-히드록시-2-(1H-인돌-3-일메틸)-펜탄2산으로도 알려져 있으며, 또는 대안으로는, 또다른 넘버링 시스템을 적용하여 4-히드록시-4-(3-인돌일메틸)글루탐산으로 공지되어 있음]에 관한 것이며, 이는 하기 화학식을 갖는 화합물이다. 또한, 모나틴은 화합물명 3-(1-아미노-1,3-디카르복시-3-히드록시-부트-4-일)-인돌; 4-(인돌-3-일메틸)-4-히드록시-글루탐산; 및 3-(1-아미노-1,3-디카르복시-3-히드록시부탄-4-일)-인돌을 갖는다. 모나틴은 천연의 고강도 감미료이다. 모나틴은 4 가지의 입체이성체 형태, 즉 2R,4R ("R,R 입체이성체" 또는 "R,R 모나틴"), 2S,4S ("S,S 입체이성체" 또는 "S,S 모나틴"), 2R,4S ("R,S 입체이성체" 또는 "R,S 모나틴") 및 2S,4R ("S,R 입체이성체" 또는 "S,R 모나틴")가 있다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, 특별한 언급이 없다면, "모나틴"은 4 가지의 모나틴 입체이성체 모두 뿐 아니라, 모나틴 입체이성체의 임의의 조합의 임의의 혼합 (예, 모나틴의 R,R 및 S,S, 입체이성체의 혼합)을 지칭한다. 본 발명은 부분적으로는 중간체, 예컨대 인돌-3-피루베이트 및 2-히드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 (모나틴 전구체, MP, 모나틴의 α-케토 형태)를 통하여 및/또는 글루코스, 트립토판, 인돌-3-락트산으로부터 모나틴을 제조하기 위한 여러 가지의 생합성 경로의 확인에 기초한다. 모나틴, 인돌-3-피루베이트 및 MP를 생성하는데 사용될 수 있는 폴리펩티드 및 핵산 서열에 관한 것이다. 모나틴의 유기 합성은 이성체의 분해를 필요로 하기 때문에, 저렴한 원료를 사용할 수 있고 단 하나의 이성체만을 생성할 수 있는 생화학적 경로가 경제적으로는 더 큰 잇점을 갖는다. 모나틴은 인돌-3-피루베이트, MP, 인돌-3-락트산, 트립토판, 및/또는 글루코스를 통하여 생산될 수 있다 (도 1). 도 1 내지 도 3 및 도 11 내지 도 13에 도시한 모나틴 또는 이의 중간체의 생산 또는 제조 방법은 목적하는 최종 생산물이 생성될 때까지 기질을 제1 산물로 전환시킨 후, 제1산물을 제2산물 등으로 전환시키는 것을 포함한다. 도 1 내지 도 3 및 도 11 내지 도 13에는 네모칸에 가능한 중간 생산물 및 최종 생산물을 기재하였다. 예를 들면, 하나의 생산물에서 또다른 생산물로의 전환, 예컨대 글루코스에서 트립토판으로, 트립토판에서 인돌-3-피루베이트로, 인돌-3-피루베이트에서 MP로, MP에서 모나틴으로 또는 인돌-3-락트산 (인돌-락테이트)에서 인돌-3-피루베이트으로의 전환은 본 명세서에서 제공된 방법 및 물질을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 전환 반응은 화학적으로 또는 생물학적으로 촉진될 수 있다. 용어 "전환하다"라는 것은 하나의 생산물 (예컨대 1차 중간체)에서 또다른 생산물 (예컨대 2차 중간체)로 전환되는 반응에서의 화학적 수단 또는 폴리펩티드를 사용하는 것을 의미한다. 용어 "화학적 전환 반응"은 폴리펩티드에 의하여 활성적으로 촉진되지 않는 반응을 의미한다. 용어 "생물학적 전환 반응"은 폴리펩티드에 의하여 활성적으로 촉진되는 반응을 의미한다. 전환 반응은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 생물학적 전환 반응을 사용하는 경우, 폴리펩티드 및/또는 세포는 예컨대 중합체 지지체상에서의 화학적 결합에 의하여 지지체상에서 부동화될 수 있다. 전환 반응은 당업자에게 공지된 임의의 반응기, 예를 들면 회분식 또는 연속식 반응기를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 1차 폴리펩티드를 기질과 접촉시켜 1차 생산물을 생성한 후, 생성된 1차 생산물을 2차 폴리펩티드와 접촉시키고, 생성된 2차 생산물을 3차 폴리펩티드와 접촉시켜 3차 생산물, 예를 들면 모나틴을 생성하는 방법을 제공한다. 사용한 폴리펩티드 및 생성된 생산물은 도 1 내지 도 3 및 도 11 내지 도 13에 도시되어 있다. 도 1 내지 도 3 및 도 11 내지 도 13에 도시된 전환 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 폴리펩티드 및 이의 암호화 서열이 개시되어 있다. 특정의 예에서, 폴리펩티드의 기질 특이성 및/또는 활성이 개질되도록 하는 1 이상의 점 돌연변이를 갖는 폴리펩티드를 사용하여 모나틴을 생성한다. 본 발명은 모나틴을 생성하는 분리된 세포 및 재조합 세포에 관한 것이다. 이들 세포는 임의의 세포, 예컨대 식물, 동물, 박테리아, 효모, 조류, 고세포(archaeal), 또는 진균 세포 등의 임의의 세포가 될 수 있다. 특정의 예에서, 개시된 세포는 트립토판 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.27), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.-), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.1), 트립토판 데히드로게나제 (EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루베이트 트랜스아미나제 (EC 2.6.1.28), L-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.2), 트립토판 옥시다제 (EC 번호 없음, Hadar et al., J. Bacteriol 125:1096-1104, 1976; 및 Furuya et al., Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), D-아미노산 데히드로게나제 (EC 1.4.99.1), D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.21), 신타제/리아제 (EC 4.1.3.-), 예컨대 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.17) 또는 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.16), 신타제/리아제 (4.1.2.-), D-트립토판 아미노트랜스퍼라제 (Kohiba 및 Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990), 페닐알라닌 데히드로게나제 (EC 1.4.1.20) 및/또는 글루타메이트 데히드로게나제 (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4)의 활성 중 1 이상 (예, 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상)을 포함한다. 또다른 예에서, 세포는 인돌락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.110), R-4-히드록시페닐락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.222), 3-(4)-히드록시페닐피루베이트 리덕타제 (EC 1.1.1.237), 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일) 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.111), 락테이트 옥시다제 (EC 1.1.3.-), 신타제/리아제 (4.1.3.-) 예컨대 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.17) 또는 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.16), 신타제/리아제 (4.1.2.-), 트립토판 데히드로게나제 (EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루베이트 트랜스아미나제 (EC 2.6.1.28), 트립토판 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.27), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.-), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.1), 페닐알라닌 데히드로게나제 (EC 1.4.1.20), 글루타메이트 데히드로게나제 (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), D-아미노산 데히드로게나제 (EC 1.4.99.1), D-트립토판 아미노트랜스퍼라제 및/또는 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.21)의 활성 중 1 이상 (예, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상)을 갖는다 또한, 개시된 세포는 트립토판 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.27), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.5), 다중 기질 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.-), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.1), 트립토판 데히드로게나제 (EC 1.4.1.19), 트립토판-페닐피루베이트 트랜스아미나제 (EC 2.6.1.28), L-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.2), 트립토판 옥시다제 (EC 번호 없음), D-아미노산 데히드로게나제 (EC 1.4.99.1), D-아미노산 옥시다제 (EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.21), 인돌락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.110), R-4-히드록시페닐락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.222), 3-(4)-히드록시페닐피루베이트 리덕타제 (EC 1.1.1.237), 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일) 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.111), 락테이트 옥시다제 (EC 1.1.3.-), 신타제/리아제 (4.1.3.-), 예컨대 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.17) 또는 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.16), 신타제/리아제 (4.1.2.-), 글루타메이트 데히드로게나제 (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), 페닐알라닌 데히드로게나제 (EC 1.4.1.20) 및/또는 D-트립토판 아미노트랜스퍼라제의 활성 중 1 이상 (예, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상)을 포함할 수 있다. 모나틴은 트립토판 및/또는 인돌-3-락트산을 1차 폴리펩티드와 접촉시키고 [여기서 1차 폴리펩티드는 트립토판 및/또는 인돌-3-락트산을 인돌-3-피루베이트 (트립토판 또는 인돌-3-락트산의 D 또는 L 형태중 어느 하나는 인돌-3-피루베이트로 전환되는 기질로서 사용될 수 있으며, 당업자는 이러한 단계를 위하여 선택된 폴리펩티드가 적절한 특이성을 이상적으로 나타낼 것이라는 것을 숙지할 것임)로 전환시킴], 생성된 인돌-3-피루베이트를 2차 폴리펩티드와 접촉시키고 (여기서 2차 폴리펩티드는 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환시킴], MP를 3차 폴리펩티드와 접촉시키는 (여기서 3차 폴리펩티드는 MP를 모나틴으로 전환시킴) 것을 포함하는 방법에 의하여 생산될 수 있다. 이러한 전환 반응에 사용될 수 있는 폴리펩티드의 예로는 도 2 및 도 3에 도시되어 있다. 본 발명의 또다른 구체예는 1 이상의 외인성 핵산 서열 (예, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 외인성 핵산 서열)에서 암호화되는 2 이상의 폴리펩티드, 또는 때때로 3 이상 또는 4 이상의 폴리펩티드를 포함하는 세포인 예컨대 MP와 같은 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 물질을 사용하여 생산물, 예컨대 모나틴, MP, 모나틴 중간체 및 모나틴 유도체를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 모나틴 및 몇몇의 모나틴 중간체는 감미제로서 또는, 모나틴 유도체의 합성에서의 중간체로서 유용할 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 모나틴을 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 모나틴 또는 이의 염의 생성 방법은 (a) 알돌라제 폴리펩티드를 암호화하는 1 이상의 핵산 및 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드를 암호화하는 1 이상의 핵산을 포함하는 미생물을 배양 배지중에서 배양하는 단계; 및 (b) 모나틴 또는 이의 염을 배양 배지 또는 배양된 미생물로부터 추출하는 단계를 포함한다. 특정의 구체예에서, 알돌라제 폴리펩티드는 ProA 알돌라제 (4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제, EC 4.1.3.17) 및 KHG 알돌라제 (4-히드록시-2-옥소글루타레이트 글리옥실레이트-리아제, EC 4.1.3.16)로부터 선택된다. 기타의 구체예에서, 미생물은 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 슈도모나스 스트라미네아(Pseudomonas straminea), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 및 이. 콜리(E. coli)로부터 선택된다. 또한, 미생물은 코리네박테리움속 및 브레비박테리움속으로부터 선택될 수 있다. 기타의 구체예에서, 배양 배지는 비이온계 세제, 페니실린, 페니실린 유도체 (예컨대 암피실린) 또는 이의 조합물을 포함한다. 비이온계 세제의 예로는 Tween, Triton X-100 또는 도데실아세트산암모늄 등이 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 비오틴을 5 ㎍/ℓ 이하의 농도로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지의 pH는 미생물이 배양되기 이전에 약 pH 7 내지 약 pH 8이다. 또한, 배양 배지는 당밀, 옥수수 침지액 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 미생물은 이. 콜리(E. coli)이며, 배양 배지는 Trp-1 + 글루코스 배지를 포함한다. 기타의 구체예에서, 미생물은 성장에 페닐알라닌 및 티로신을 필요로 하며, 배양 배지는 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 또한, 미생물은 aspC 및 proA 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 미생물은 글루타메이트를 생산 및 분비하는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 균주가 될 수 있다. 특정의 구체예에서, 모나틴 또는 이의 염은 미생물 (예, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)로부터 분비된다. 또다른 구체예에서, 미생물은 발효기내에서 배양된다. 특정의 구체예에서, 배양 배지는 트립토판, 피루브산, 비이온계 세제 (예컨대 Tween), 페니실린, 페니실린 유도체 또는 이의 조합물을 포함한다. 기타의 구체예에서, 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드는 트립토판 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.27), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.1), 방향족 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.5) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.21)로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 (a) 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (ATCC 13058)을 배양 배지중에서 배양하는 단계; 및 (b) 모나틴 또는 이의 염을 배양 배지 또는 배양된 미생물로부터 추출하는 단계를 포함하는, 모나틴 또는 이의 염의 제조 방법을 특징으로 한다. 특정의 구체예에서, 배양 배지는 Tween, 페니실린, 페니실린 유도체 또는 이의 조합물을 포함한다. 또한, 본 발명은 알돌라제 폴리펩티드를 암호화하는 1 이상의 핵산 및 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드를 암호화하는 1 이상의 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 외인성 핵산, 재조합 핵산 및 이의 조합물로부터 선택되며, 모나틴 또는 이의 염을 생산하는 미생물을 특징으로 한다. 특정의 구체예에서, 알돌라제 폴리펩티드는 ProA 알돌라제 (4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제, EC 4.1.3.17) 및 KHG 알돌라제 (4-히드록시-2-옥소글루타레이트 글리옥실레이트-리아제, EC 4.1.3.16)로부터 선택된다. 기타의 구체예에서, 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드는 트립토판 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.27), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.1), 방향족 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.5) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 폴리펩티드 (EC 2.6.1.21)로부터 선택된다. 미생물은 피루베이트를 과생산할 수 있는 것이며, 및/또는 티아민 영양요구균주, 페닐알라닌 및 티로신 영양요구균주 또는 리포산 영양요구균주이다. 특정의 구체예에서, 미생물은 캔디다 글라브라타(Candida glabrata), 트리코스포론 쿠타네움(Trichosporon cutaneum), 캔디다 리포리티카(Candida lipolytica) 및 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택된다. 기타의 구체예에서, 미생물은 aspC 및 proA 유전자를 포함한다. 특정의 구체예에서, 미생물은 aspC 및 proA 유전자 및 1 이상의 트립토판 오페론 유전자를 포함한다. 기타의 구체예에서, 미생물은 이. 콜리(E. coli)이다. 기타의 구체예에서, 미생물은 결손성 F1- ATPase 유전자, 내인성 lipA 유전자에서의 파열, 파열된 pheA 유전자, 파열된 내인성 트립토파나제 (tna) 유전자 및/또는 1 이상의 트립토판 생합성 유전자의 2 이상의 복제를 포함한다. 특정의 구체예에서, 미생물은 트립토판을 과생산한다. 기타의 구체예에서, 미생물은 ppsA 유전자를 과발현하며, 해당 대조군 미생물에 대하여 증가량의 3-데옥시-D-아라비노-헤파툴로손산 7-포스페이트 (DAHP) 신타제 활성을 지니며, 포스포에놀피루베이트 (PEP) 신타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 핵산은 외인성 핵산, 재조합 핵산 및 이의 조합물 및/또는 tkt 유전자로부터 선택된다. 기타의 구체예에서, 미생물은 이. 콜리(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다. 특정의 구체예에서, 미생물은 트립토파나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산을 더 포함한다. 기타의 구체예에서, 미생물은 모나틴 또는 이의 염을 분비하며 및/또는 지방산 영양요구균주이다. 기타의 구체예에서, 미생물은 알돌라제를 발현시키는 핵산을 포함하는 박테리아의 균주이며, 여기서 핵산으로부터 발현된 알돌라제는 입체이성체가 풍부한 모나틴 혼합물을 생산할 수 있다. 특정의 구체예에서, 입체이성체가 풍부한 모나틴 혼합물은 주로 S,S 모나틴 또는 이의 염이다. 대안으로는, 입체이성체가 풍부한 모나틴 혼합물은 주로 R,R 모나틴 또는 이의 염이다. 한 구체예에서, 미생물은 트립토판 수용(uptake) 폴리펩티드를 암호화하는 1 이상의 핵산을 과발현한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 모나틴 또는 이의 염이 생산되는 조건하에서 배양 배지중에서 모나틴 또는 이의 염을 생산하는 미생물을 배양하는 단계 및 (b) 모나틴 또는 이의 염을 배양 배지 또는 배양된 미생물로부터 얻는 단계를 포함하는, 모나틴 또는 이의 염의 제조 방법을 특징으로 한다. 특정의 구체예에서, 미생물은 모나틴 또는 이의 염을 분비하며, 및/또는 지방산 영양요구균주이다. 또한, 본 발명은 (a) 모나틴 또는 이의 염, 2-히드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 또는 이의 염, 모나틴 또는 이의 염의 유사체, 2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 또는 이의 염의 유사체 및 이의 조합물로부터 선택된 탄소/에너지 공급원의 존재하에서 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 세포가 탄소/에너지 공급원을 피루베이트로 전환시켜 세포가 모나틴 또는 이의 염을 합성할 수 있다는 것을 나타내는 세포 성장을 테스트하는 단계를 포함하는, 모나틴 또는 이의 염을 합성시킬 수 있는 세포를 확인하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 피루베이트 영양요구균주이며, 피루베이트는 세포 탄소/에너지 공급원의 대사에 의하여 세포중에서 생산된다. 기타의 구체예에서, 세포는 pykA 및 pykF 유전자에서의 파열을 포함한다. 또한, 본 발명은 (a) 트립토판의 부재하에 그리고 모나틴 또는 이의 염, 2-히드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 또는 이의 염, 또는 이의 조합물의 존재하에 트립토판 영양요구균주인 세포를 배양시키는 단계 및 (b) 트립토판 영양요구균주인 세포의 성장을 테스트하는 단계 (여기서 세포의 성장은 세포가 모나틴 또는 이의 염, 2-히드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 또는 이의 염, 또는 이의 조합물로부터의 트립토판을 합성하여 세포가 트립토판으로부터 모나틴 또는 이의 염 또는 2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 또는 이의 염, 또는 이의 조합물을 합성할 수 있다는 것을 나타냄)를 포함하는, 트립토판으로부터의 모나틴 또는 이의 염 또는 2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-케토-글루타르산 또는 이의 염, 또는 이의 조합물을 합성할 수 있는 세포를 확인하는 방법을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 (a) 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 슈도모나스 스트라미네아(Pseudomonas straminea) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)로부터 선택된 미생물을 미생물 배양 배지중에서 배양하는 단계; 및 (b) 모나틴 또는 이의 염을 배양 배지 또는 배양된 미생물로부터 추출하는 단계를 포함하는, 모나틴 또는 이의 염의 제조 방법을 특징으로 한다. 특정의 구체예에서, 미생물은 유전자 변형되지 않았다. 기타의 구체예에서, 배양 배지는 PHB 배지를 포함한다. 또한, 배양 배지는 트립토판, 피루베이트, 비이온계 세제, 페니실린, 페니실린 유도체 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 미생물은 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti) 또는 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)이다. 기타의 구체예에서, 미생물은 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)이며, 및/또는 배양 배지는 트립토판 및 피루베이트를 더 포함한다. 기타의 구체예에서, 배양 배지는 TY 배지를 포함한다. 또한, 배양 배지는 트립토판, 피루베이트 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용한 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재한 것과 유사하거나 또는 등가의 방법 및 물질을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있기는 하나, 적절한 방법 및 물질은 후술하는 바와 같다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 출원, 특허 및 기타의 참증은 본 명세서에서 참고로 인용한다. 분쟁의 경우, 정의를 비롯한 본 발명의 명세서는 이를 조절할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시로서만 제시할 뿐, 이로써 본 발명을 제한하고자 하는 의도가 아니다. 본 발명의 기타의 특징 및 잇점은 하기의 상세한 설명으로부터 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.