글리코페질화 인자 나인 document_id A220623042297

비타민 K-의존성 단백질 (예를 들어, 인자 IX)은 그들의 아미노 말단 45개의 잔기에 9 내지 13개의 감마-카복시글루탐산 잔기 (Gla)를 함유한다. Gla 잔기는 비타민 K를 이용하여 단백질 전구체 내의 글루탐산 잔기의 측쇄를 카복실화시키는 간 내의 효소에 의해서 생산된다. 비타민 K-의존성 단백질은 다수의 생물학적 과정에 포함되며, 이들 과정 중에서 가장 잘 기술된 것은 혈액 응고이다 (문헌 (Nelsestuen, Vitam. Horm. 58 : 355-389 (2000)에서 검토됨). 비타민 K-의존성 단백질에는 단백질 Z, 단백질 S, 프로트롬빈 (인자 II), 인자 X, 인자 IX, 단백질 C, 인자 VII, Gas6, 및 매트릭스 GLA 단백질이 포함된다. 인자 VII, IX, X 및 II는 프로응고 (procoagulation) 과정에서 작용하는 한편, 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z는 항응고제 역할로 작용한다. Gas6은 성장 정지-특이적 유전자 6 (gas6)에 의해서 코드화된 성장 정지 호르몬이며, 단백질 S와 연관된다 (참조: Manfioletti et al. Mol. Cell. Biol. 13 : 4976-4985 (1993)). 매트릭스 GLA 단백질은 통상적으로 뼈에 존재하며, 순환에서 연조직의 석회화를 예방하는데 중요하다 (Luo et al. Nature 386 : 78-81 (1997)). 혈액응고의 조절은 혈병 및 혈전의 형성 실패 및 원치 않는 혈병의 형성 둘 다를 포함하는 다수의 주요한 건강상의 문제를 나타내는 과정이다. 원치 않는 혈병을 방지하는 약제는 다수의 상황에서 사용되며, 다양한 약제를 이용할 수 있다. 불행하게도, 대부분의 현행 치료법들은 바람직하지 않은 부작용을 갖는다. 와르파린과 같은 경구적으로 투여된 항응고제는 간에서 비타민 K의 작용을 억제하여 비타민 K-의존성 단백질 내의 글루탐산 잔기의 완전한 카복실화를 방지하고, 순환계 내의 활성 단백질의 농도를 저하시키고, 혈병을 형성하는 능력을 저하시킴으로써 작용한다. 와르파린 요법은 약물의 그의 표적과의 경쟁적 성질에 의해서 복잡하게 된다. 식이성 비타민 K의 변동은 와르파린의 과용량 또는 저용량을 유도할 수 있다. 응고활성에서의 변동은 이 치료법의 바람직하지 않은 결과이다. 저분자량 헤파린을 포함하는 헤파린과 같은 주입된 물질도 또한, 통상적으로 사용되는 항응고제이다. 또한, 이들 화합물은 과용량이 되기 쉬우며, 반드시 주의해서 모니터하여야 한다. 항응고제의 더 새로운 카테고리에는 인자 VIIa 및 IXa와 같은 활성-부위 변형된 비타민 K-의존성 응고인자가 포함된다. 활성부위는 아미노산 또는 짧은 펩타이드의 클로로메틸케톤 유도체와 같은 세린 프로테아제 억제제에 의해서 차단된다. 활성부위-변형된 단백질은 그들의 각각의 보조인자 (cofactors)와의 컴플렉스를 형성하는 능력을 유지하지만, 불활성이어서 효소 활성을 생성시키지 않으며 각각의 활성 효소와 보조인자의 컴플렉스 형성을 방지한다. 결국, 이들 단백질은 다른 항응고제의 부작용이 없이 항응고 요법의 이점을 제공하는 것으로 보인다. 활성부위 변형된 인자 Xa는 이 그룹의 또 다른 가능한 항응고제이다. 그의 보조인자 단백질은 인자 Va이다. 활성부위 변형된 활성화 단백질 C (APC)는 또한, 응고의 효과적인 억제제를 형성할 수 있다 (참조: Sorensen et al. J. Biol. Chem. 272 : 11863-11868 (1997)). 활성부위 변형된 APC는 인자 Va에 결합하여 인자 Xa가 결합하는 것을 방지한다. 비타민 K-의존성 응고인자의 사용에 대한 주된 제한점은 비용이다. 비타민 K-의존성 단백질의 생합성은 소수의 동물세포 타입에 존재하는 온전한 글루탐산 카복실화 시스템에 따라 좌우된다. 이들 단백질의 과생산은 이 효소 시스템에 의해서 제한된다. 또한, 이들 단백질의 효과적인 용량은 크다. 통상적인 투약량은 체중 ㎏당, 1000 ㎍의 펩타이드이다 (참조: Harker et al. 1977, 상기 참조). 치료학적 펩타이드의 사용을 저해하는 또 다른 현상은 단백질 글리코실화의 잘 알려진 관점으로 이들 펩타이드에 의해서 나타나는 비교적 짧은 생체내 반감기이다. 전반적으로, 짧은 생체내 반감기의 문제는 치료학적 글리코펩타이드가 고용량으로 자주 투여되어야 하는 것을 의미하며, 궁극적으로는 더 장기간 지속성이며 더 효과적인 당단백질 치료제를 제조하는 더 효율적인 방법을 이용할 수 있는 경우에 필요할 수 있는 것보다 더 큰 건강 보호비용으로 해석된다. 예를 들어, 인자 VIIa는 이 문제를 설명한다. 인자 VII 및 VIIa는 인간에게서 약 2-4시간의 순환 반감기를 갖는다. 즉, 2-4시간 이내에 혈청 중의 펩타이드의 농도는 반으로 감소된다. 인자 VIIa가 특정한 형태의 혈우병을 치료하기 위한 응고촉진물질 (procoagulant)로서 사용되는 경우에, 표준 프로토콜은 VIIa를 매 2시간 마다 고용량 (45 내지 90 .mu.g/체중 ㎏)으로 주사하는 것이다 (참조: Hedner et al., Transfus. Med. Rev. 7: 78-83 (1993)). 따라서, 응고촉진물질 또는 항응고제 (인자 VIIa의 경우)로서 이들 단백질을 사용하는 것은 단백질을 빈번한 간격으로 고용량으로 투여하는 것을 필요로 한다. 비용 효율이 높은 글리코펩타이드 치료제를 제공하는 문제에 대한 한가지 해결책은 더 긴 생체내 반감기를 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다. 예를 들어, 개선된 약력학적 특성을 갖는 글리코펩타이드 치료제는 펩타이드 골격에 합성 폴리머를 부착시킴으로써 생산되어 왔다. 펩타이드에 컨쥬게이트된 폴리머의 예는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")이다. 펩타이드 치료제를 유도체화시키기 위한 PEG의 사용은 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,179,337 호 (Davis et al.)에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜에 커플링된 효소 및 펩타이드와 같은 비-면역원성 폴리펩타이드가 기술되어 있다. 감소된 면역원성 이외에도, 순환계에서의 청소시간 (clearance time)은 문제의 폴리펩타이드의 PEG-컨쥬게이트의 증가된 크기로 인하여 연장된다. 펩타이드에 대한 PEG 및 그의 유도체의 부착의 주모드는 펩타이드 아미노산 잔기를 통한 비-특이적 결합이다 (참조예: 미국 특허 제 4,088,538 호, 미국 특허 제 4,496,689 호, 미국 특허 제 4,414,147 호, 미국 특허 제 4,055,635 호, 및 PCT WO 87/00056). 펩타이드에 PEG를 부착시키는 또 다른 모드는 글리코펩타이드 상의 글리코실 잔기의 비-특이적 산화반응을 통한 것이다 (참조예: WO 94/05332). 이들 비-특이적 방법에서, 폴리(에틸렌글리콜)은 펩타이드 골격 상의 반응성 잔기에 무작위적이며 비-특이적인 방식으로 첨가된다. 물론, PEG 분자의 무작위적 첨가는 최종생성물의 균일성의 결여, 및 펩타이드의 생물학적 또는 효소적 활성의 감소 가능성을 포함한 그의 결점들을 갖는다. 따라서, 치료학적 펩타이드의 생산을 위해서는 특이적으로 표지되고 쉽게 특정화할 수 있으며, 필수적으로 균일한 생성물의 형성을 유도하는 유도체화 전략이 탁월하다. 이러한 방법이 개발되었다. 특이적으로 표지된 균질의 펩타이드 치료제는 효소의 작용에 의해서 시험관내에서 생산될 수 있다. 펩타이드에 합성 폴리머 또는 그 밖의 다른 라벨을 부착시키는 전형적인 비-특이적 방법과는 달리, 효소-기본 합성은 위치선택성 및 입체선택성의 이점을 갖는다. 표지된 펩타이드의 합성에 사용하기 위한 효소의 두가지 주부류는 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어, 시알릴트랜스퍼라제, 올리고사카릴트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사밀트랜스퍼라제), 및 글리코시다제이다. 이들 효소는 추후에 변형되어 치료학적 부위를 포함할 수 있는 당의 특이적 부착을 위해서 사용될 수 있다. 대체방식으로, 글리코실트랜스퍼라제 및 변형된 글리코시다제를 사용하여 펩타이드 골격에 변형된 당을 직접 전이시킬 수도 있다 (참조예: 미국 특허 제 6,399,336 호 및 미국 특허출원공개 제 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838 및 20040142856 호, 이들은 각각 본 발명에 참고로 포함된다). 화학적 및 효소적 합성요소 둘 다를 결합시키는 방법도 또한 공지되어 있다 (참조예: Yamamoto et al. Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998) 및 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허출원공개 제 20040137557 호). 인자 IX는 매우 유용한 치료학적 펩타이드이다. 비록 치료학적으로 유용한 형태의 인자 IX가 오늘날 사용되고 있지만, 이들 펩타이드는 생성된 분리된 당단백질 생성물의 약력학을 증진시키는 변형에 의해서 개선될 수 있다. 따라서, 개선된 유효성 및 더 우수한 약력학을 갖는 더 장기간 지속성의 인자 IX 펩타이드에 대한 필요성이 본 기술분야에서 남아 있다. 또한, 최대수의 개체에 대해서 효과적이기 위해서 이것은 반드시, 계속 반복적으로 쉽게 재현될 수 있는, 예견가능하며 필수적으로 균질인 구조를 갖는 개선된 치료학적 약력학을 갖는 인자 IX 펩타이드를 산업적 규모로 생산할 수 있어야 한다. 다행히도, 개선된 약력학을 갖는 인자 IX 펩타이드 및 이들을 제조하는 방법이 현재 발견되어 있다. 개선된 약력학을 갖는 인자 IX 펩타이드 이외에도, 본 발명은 또한 이들 인자 IX 펩타이드의 생산을 위한 산업적으로 실용적이며 비용 효율이 큰 방법을 제공한다. 본 발명의 인자 IX 펩타이드는 PEG 부위, 치료학적 부위, 생체분자 (biomolecules) 등과 같은 변형성 그룹을 포함한다. 따라서, 본 발명은 인자 IX가 효과적인 치료법을 제공하는 상태 및 질환의 치료를 위해서 개선된 치료학적 유효성 및 개선된 약력학을 갖는 인자 IX 펩타이드에 대한 필요성을 충족시킨다.