아데노바이러스-형질감염된 일차세포 및 경로 지도작성방법 document_id A220623042303

세포내 시그날링 경로는 그의 발현이 초기 자극에 의해서 시작된 유전자-대-유전자 상호작용의 캐스케이드 (cascade)에 의해서 조절되는 유전자 세트이다. 바꾸어 말하면, 세포내 시그날링 경로의 초기 자극은 직접적으로 또는 경로 상의 또 다른 유전자를 통해서 간접적으로 경로 상의 각각의 유전자의 발현을 조절한다. 공지된 시그날링 경로는 면역반응, 발생, 유사분열 및 염증을 포함하는 광범위한 생물학적 활성에 관여하며, 마이토젠-활성화된 단백질 키나제 (“MAPK”) 경로, 단백질 키나제 A (“PKA”) 시그날링 경로, 단백질 키나제 C (“PKC”) 시그날링 경로, 타입 I 인터페론 시그날링 경로, 칼시뉴린 (“CaN”) 시그날링 경로, κB 세포의 시스-작용성 핵인자 (“NFκB”) 시그날링 경로, 및 IκB 키나제 (“IKK”) 시그날링 경로를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 시그날링 경로에서의 결함은 광범위한 질환상태와 관련되어 있지만, 대부분의 경우에 초기 자극과 최종 세포반응 사이의 시그날링 경로에 대해서는 거의 이해되지 않고 있다. 경로 지도작성은 일반적으로 경로의 초기 자극과 최종적인 반응 사이의 단계들을 설명하는 것이다. 본 발명의 목적에 따르면, “경로 지도작성”은 후보 시스-작용성 요소가 소정의 시그날링 경로에 의해서 직접적으로 또는 간접적으로 조절되는지 여부를 결정하는데 관한 것이다. 경로 지도작성의 공지된 방법은 시험하고자 하는 조절요소에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 (reporter gene)를 함유하는 DNA 플라스미드에 의해서 형질감염된 배양 세포주로부터의 숙주세포를 사용한다. 리포터 유전자의 사용은 본 기술분야에서 잘 확립되어 있다 [Kain, SR, and Ganguly, S, Overview of Genetic Reporter Systems, Unit 9.6 in Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel, FM, et al., (Wiley and Sons, NY, 1995)]. 형질감염은 배양된 포유동물 세포와 같은 숙주세포 내로 이종 DNA를 도입시키는 것을 나타낸다. 형질감염은 유전자의 기능, 조절 및 상호작용 및 이들의 개개 유전자 생성물을 분석하는 강력한 도구인 것으로 입증되었다. 세포를 형질감염시키기 위한 방법은 본 기술분야에서 잘 확립되어 있다. 형질감염의 화학적 및 물리적 방법에는 DEAE덱스트란 (Fox RM, et al, Biochemistry Oct 4;16(20):4470-7, PMID 911769 (1977)), 칼슘 포스페이트 (Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., 0026# Baltimore, D.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8392 (1993)), 리포좀-매개된 형질감염 (Zhang WW, et al., Biotechniques Nov;15(5):868-72 (1993)), 미량-주사 (micro-injection)(Colbere-Garapin F, and Garapin AC, Dev Biol Stand;55:267-71, PMID: 6329857 (1983)), 및 전기천공 (electroporation)(Neumann E and Kakorin S, Technol Cancer Res Treat. Oct;1(5):329-40(2002))이 포함된다. 형질감염을 위한 재조합 아데노바이러스 벡터의 사용도 또한 본 기술분야에서 잘 확립되어 있다 (Berkner, KL and Sharp, PA Nucelic Acids Res. 11:6003-6020 (1983); Berkner, KL and Sharp, PA BioTechniques 6:616-629 (1988); Bett, AJ, Haddara, W, Prevec, L and Graham, FL PNAS USA 91:8802-8806 (1994); Hitt, M, Addison, CL, and Graham, FL Adv. Pharmacol. 40:137-206 (1997)). 재조합 아데노바이러스를 사용하여 무엇보다도 특히 심장조직 (Ardehali, A. J. Thor. Cardiovas. Surg. 111:246-252 (1996)) 및 림프구 (Leon, RP, Hedlund, T, Meech, SJ, Li, S, Schaack, J, Hunger, SP, Duke, RC, and DeGregori, J PNAS USA 95:13159-13164 (1998))을 형질감염시켰다. 사람 아데노바이러스는 수용체-매개된 세포내이입에 의해서 세포 내로 들어가는 이본쇄 DNA 바이러스이다. 이들 바이러스는 증식 및 조작이 용이하고, 생체내 및 시험관내에서 광범위한 숙주 범위를 나타내기 때문에, 유전자 전이에 매우 적합한 것으로 생각되어 왔다. 아데노바이러스는 정지상뿐만 아니라 복제성의 표적세포를 감염시키고, 숙주 게놈 내로 통합하기 보다는 염색체외적으로 존재할 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 이종 DNA (약 7 kb)의 비교적 큰 절편을 수용하며, 고역가 바이러스 생산의 이점을 가질 수 있다. 경로 지도작성을 위해서 사용된 리포터 작제물에 대한 공지된 벡터에는 BD 바이오사이언스 클론테크 (BD Biosciences Clontech)로부터 시판품으로 입수할 수 있는 pCRE-d2EGFP 플라스미드가 포함된다. 이 플라스미드는 녹색 형광 단백질 (“GFP”) 리포터 유전자에 작동적으로 연결된 사이클릭-AMP 반응요소 (“CRE”)를 함유하며, Jun N-말단 키나제 (“JNK”) 시그날링 경로, p38 MAPK 시그날링 경로, 및 단백질 키나제 A (“PKA”) 시그날링 경로와 같은 경로 상에서의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 이 플라스미드는 이. 콜라이(E. coli) 내에서의 증식을 위한 복제의 pUC 오리진 (origin), 및 일본쇄 DNA의 생산을 위한 바이러스성 f1 오리진을 사용한다. 이 플라스미드는 진핵세포 내에서 아데노바이러스-기본 벡터보다 훨씬 더 낮은 효율로 형질감염시키며, 일차 진핵세포 배양물이 아닌 단지 배양된 진핵세포주 상에서 사용되기에 충분히 효율적이다. 면역세포의 경로 지도작성을 위한 공지된 벡터는 일차 면역세포 상에서 사용하기에 실용적이도록 충분히 효율적이지 않기 때문에, 선행기술의 방법을 사용한 경로 지도작성은 현재 단지 배양된 세포주 상에서만 수행될 수 있다. 그러나, 불멸화된 배양된 세포주는 그들의 비-불멸화된 대응물과는 현저하게 상이한 단백질 발현패턴을 갖는 경향이 있다. 고등 유기체의 일차 숙주세포 상에서 그들 세포의 정상적인 발현패턴을 불필요하게 파괴하지 않으면서 경로 지도작성을 수행할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 일차 면역세포 상에서 이들을 불멸의 세포주로 형질전환시키지 않으면서 경로 지도작성을 수행할 수 있는 것이 특히 바람직하다. 발명의 간단한 요약 한가지 관점에서, 본 발명은 면역세포를 후보 시스-요소에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스로 형질감염시키고; 리포터 유전자 활성의 기본 수준을 측정하고; 면역세포에 자극을 적용하고; 상기 자극에 대한 반응으로 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계를 갖는, 면역세포 내에서 시그날링 경로의 발현을 조절하는 것으로 알려진 자극이 후보 시스-요소의 발현을 조절할 수 있는지의 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다. 추가의 관점에서, 자극은 조절 단백질의 발현을 조절한다. 또 다른 추가의 관점에서, 이 방법은 조절 단백질에 대한 발현 시스템에 의한 동시-형질감염을 추가로 포함한다. 대안의 관점에서, 자극은 후보 조절 화합물을 도입시키는 것이다. 추가의 관점에서, 리포터 유전자는 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (“GFP”), β-갈락토시다제 (“GAL”), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (“CAT”), 또는 IκBsd와 같은 서프레서 유전자 (suppressor gene)이다. 또 다른 관점에서, 시스-요소는 염증과 관련된다. 또 다른 관점에서, 시스-요소는 AP-1, CRE, ISRE, NFAT, NFκB, 또는 SRE이다. 또 다른 관점에서, 면역세포는 대식세포, CD4+ T 세포, 또는 미성숙 수상돌기 세포(dendritic cell)이다. 한가지 관점에서, 본 발명은 면역세포를 시그날링 경로에 속하는 시스-요소에 작동적으로 연결된 서프레서 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스로 형질감염시키고; 서프레서 유전자의 발현을 유도하는 단계를 갖는, 면역세포 내에서 시그날링 경로의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다. 추가의 관점에서, 시그날링 경로는 NFκB 시그날링 경로이다. 추가의 또 다른 관점에서, 서프레서 유전자는 IκBsd이다. 추가의 관점에서, 면역세포는 대식세포, CD4+ T 세포, 또는 미성숙 수상돌기세포이다.