증가된 ＦＣ 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 가진ＣＤ20 항체 document_id A220623042369

면역계 및 항-CD20 항체 인간을 포함한 척추동물의 면역계는, 침범하는 외부 미생물체 ("항원") 를 정확하고도 특이적으로 인지하고, 결합하여 파괴하도록 진화된 여러 기관 및 세포 유형으로 이루어진다. 림프구는 면역계의 적절한 기능에 있어서 중요하다. 상기 세포는 흉선, 비장 및 골수 (성인) 에서 생성되며, 성인 인간의 순환계에 존재하는 총 백혈구의 약 30% 를 차지한다. 두 가지 주요한 림프구의 하위 집단이 존재한다 : T 세포 및 B 세포. T 세포가 세포 매개성 면역을 담당하는 반면, B 세포는 항체 생성 (체액성 면역) 을 담당한다. 그러나, 통상적인 면역 반응에서, T 세포 및 B 세포는 상호의존적으로 작용한다 : T 세포 수용체가 항원 제시 세포 표면상의 주 조직적합성 복합체 ("MHC") 당단백질에 결합된 항원 절편에 결합하는 경우 T 세포가 활성화되며 ; 그러한 활성화는, B 세포를 자극하여 항원에 대한 항체 ("면역글로불린") 를 분화 및 생성하는 생물학적 매개체 ("인터루킨") 의 방출을 유도한다. 숙주 내의 각 B 세포는 한 가지 특정한 유형 및 특이성의 항체를 발현하고, 상이한 B 세포는 상이한 항원들에 특이적인 항체들을 발현한다. B 세포 증식 및 항체 생성이 외부 항원에 대한 반응으로서 급격히 증가하고, 일단 외부 항원이 중성화되면 둘 다 통상적으로 정지 (또는 실질적으로 감소) 된다. 그러나, 이따금 특정 B 세포의 증식이 계속해서 줄어들지 않는데 ; 그러한 증식은 "B 세포 림프종" 이라 불리는 암을 유발할 수 있다. T 세포 및 B 세포 모두 분화 및 식별을 위한 "마커(marker)" 로서 사용될 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 상기 인간 B 세포 마커 중 하나가 인간 B 림프구-제한적 분화 항원 Bp35 로서, "CD20" 으로 불린다. CD20 은 초기 예비-B 세포 발생 중에 발현되며, 원형질 세포 분화시까지 남아 있다. 구체적으로는, CD20 분자는 세포 주기의 개시 및 분화에 필요한 활성화 과정의 단계를 조절할 수 있으며, 보통 신생물성 ("종양") B 세포에서 매우 높은 수준으로 발현된다. CD20 이 "악성" B 세포, 즉, 증식이 줄어들지 않아 B 세포 림프종으로 진행될 수 있는 B 세포 상에 높은 수준으로 존재하기 때문에, CD20 표면 항원은 B 세포 림프종의 "표적화" 를 위한 후보로서의 잠재력을 가진다. 본질적으로, 상기 표적화는 하기와 같이 일반화될 수 있다 : B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 예컨대 주사에 의해 환자에 도입한다. 상기 항-CD20 항체는 (표면적으로는) 정상 및 악성 B 세포 모두의 CD20 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다 ; CD20 표면 항원에 결합된 항-CD20 항체가 신생물성 B 세포의 파괴 및 고갈을 초래할 수 있다. 또한, 종양을 파괴하는 잠재력을 지닌 화학적 제제 또는 방사성 표지를 항-CD20 항체에 콘쥬게이션하여, 상기 제제가 예컨대 신생물성 B 세포에 특이적으로 "전달" 되게 할 수 있다. 접근법에 관계없이, 일차적 목표는 종양을 파괴하는 것이다 : 구체적인 접근법은 사용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있으며, 따라서 CD20 항원을 표적화하는데 사용가능한 접근법은 상당히 다양할 수 있다. CD20 양성 B-세포, 저등급 또는 소포성 비-호지킨(Non-Hodgkin's) 림프종의 치료를 위한 리툭시마브 (RituxanTM ; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, 및Genentech Inc., San Francisco, CA), 진행성 유방암의 치료를 위한 트라스투주마브 (HerceptinTM ; Genentech Inc,) (Grillo-Lopez, A.-J., 등, Semin. Oncol. 26 : 66 - 73 (1999) ; Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21 : 309 - 18 (1999)), 재발된 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 겜투주마브 (MylotargTM, Celltech/Wyeth-Ayerst), 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병의 치료를 위한 알렘투주맙 (CAMPATHTM, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) 에 대한 미국 식품의약품 안정청의 승인으로 드러나듯이, 비(非)콘쥬게이션 단일클론 항체 (mAb) 는 유용한 암치료용 의약이 될 수 있다. 이들 제품의 성공은 그 효능 뿐만 아니라 그의 뛰어난 안전성 프로파일에 기인한다 (Grillo-Lopez, A.-J., 등, Semin. Oncol. 26 : 66 - 73 (1999) ; Goldenberg, M.M., Clin. Ther. 21 : 309 - 18(1999)). 이들 약물의 성공에도 불구하고, 비콘쥬게이션 mAb 요법에 의해 통상적으로 얻을 수 있는 것보다 특이성이 더 높은 항체 활성을 수득하는 데 현재 많은 관심이 집중되고 있다. 쥐과동물 단일클론 항체, B-Ly1 은 인간 CD20 에 대하여 특이적인 것으로 알려진 또다른 항체이다 (Poppema, S. 및 Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)). 여러 연구 결과는, Fc-수용체-의존적 기작이 종양에 대한 세포독성 항체의 작용에 실질적으로 기여함을 암시하며, 종양에 대한 최적의 항체는 우선적으로 활성화 Fc 수용체에 결합하고 저해성 파트너인 FcγRⅡB 에는 최소한으로 결합하는 것을 나타낸다 (Clynes, R. A., 등, Nature Medicine 6 (4): 443-446 (2000); Kalergis, A. M., and Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12): 1653-1659 (June 2002)). 예를 들어, 최소한 하나 이상의 연구 결과는, 특정 FcγRⅢa 수용체가 항체 치료법의 효능과 밀접하게 연관되어 있음을 제시하고 있다 (Cartron, G., 등, Blood 99 (3): 754-757 (February 2002)). 상기 연구는, FcγRⅢa 에 동종접합성인 환자가 이종접합성인 환자에 비해 리툭시마브에 대한 반응이 더 양호함을 보여주었다. 그 저자들은, 상기 우수한 반응성이, 항체의 FcγRⅢa 에 대한 생체 내 더 우수한 결합으로 인하여 림프종 세포에 대한 더 나은 ADCC 활성을 가져오기 때문인 것으로 결론지었다 (Cartron, G., 등, Blood 99 (3): 754-757 (February 2002)). CD20 표면 항원을 표적화하려는 다양한 시도가 보고되어 왔다. 쥐과동물 (마우스) 단일클론 항체 1F5 (항-CD20 항체) 가 연속적 정맥내 주입에 의해 B 세포 림프종 환자에게 투여된 것으로 보고되었다. 순환하는 종양 세포를 고갈시키기 위해서는 극히 높은 수준 (003e# 2 그램) 의 1F5 가 필요한 것으로 보고되었으며, 그 결과는 "일시적인" 것으로 설명되었다 ("Press 등, "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas" Blood 69/2: 584-591 (1987)). 상기 접근법의 잠재적 문제점은, 비인간 단일클론 항체 (예컨대, 쥐과동물 단일클론 항체) 는 전형적으로 인간 효과기(effector) 기능성을 결여한다는 점, 즉 이들은 특히 보체 의존적 파쇄를 매개하거나 항체 의존적 세포 독성 또는 Fc-수용체 매개 식균작용을 통해 인간 표적 세포를 파쇄하지 못한다는 점이다. 더욱이, 비-인간 단일클론 항체는 인간 숙주에 의해 외부 단백질로 인지될 가능성이 있다 ; 따라서, 상기 외부 항체의 반복적 주사는, 면역 반응을 유도하여 해로운 과민 반응을 초래할 수 있다. 쥐과동물-유래의 단일클론 항체에 있어서, 이를 종종 인간 항-마우스 항체 반응, 또는 "HAMA" 반응이라 부른다. 또한, 이들 "외부" 항체는 숙주의 면역계에 의해 공격을 당하여, 그 표적 부위에 도달하기도 전에 사실상 중화될 수 있다. B-세포 장애의 치료에 효과적인 쥐과동물 단일클론 항체의 능력을 향상시키기 위한 또다른 접근법으로서, 항체에 방사성 표지 또는 독소를 콘쥬게이션하여 표지 또는 독소가 종양 부위에 위치하도록 하는 방법이 보고되었다. 예를 들어, 상기 1F5 항체를 요오드-131 ("131I") 로 "표지(labeled)" 하여, 두 명의 환자에서의 생체내 분포를 측정한 것이 보고되었다. [Eary, J. F. 등, "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8 : 1257 - 1268 (1990) ; 및, Press, O. W. 등, "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. Onc. 7/8 : 1027 - 1038 (1989) (131I-표지된 IF-5 로 치료된 한 환자에게서 "부분적 반응" 을 얻었음을 제시함) ; Goldenberg, D. M. 등, "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. Clin. Onc. 9/4 : 548 - 564 (1991) (여러번 주사 투여받은 환자 8명 중 3명이 HAMA 반응을 나타낸 것으로 보고됨); Appelbaum, F. R."Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem./Onc. Clinics of N. A. 5/5: 1013-1025 (1991) (review article); Press, O. W. 등 "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support." New England J. Med. 329/17: 1219-1223 (1993) (요오드-131 표지된 항-CD20 항체 IF5 및 B1); 및 Kaminski, M. G. 등 "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody". New England J. Med. 329/7 (1993) (요오드-131 표지된 항-CD20 항체 B1; 이하 "Kaminski")] 참조. 독소 (즉, 독소루비신 또는 마이토마이신 C 와 같은 화학요법제) 또한 항체에 콘쥬게이션되었다. 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 92/07466 (공개일 1992년 5월 14일) 참조. 2 이상의 상이한 종 (예컨대, 마우스와 인간) 에서 유래된 항체 일부를 포함하는 키메라 항체가 "콘쥬게이션" 항체에 대한 대안으로서 개발되었다. 예를 들어, [Liu, A. Y. 등 "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987)] 은 CD20 항원에 대한 마우스/인간 키메라 항체를 기술하고 있다. PCT 공개 번호 WO 88/04936 역시 참조. 예를 들어, 키메라 항-CD20 항체인 리툭시마브 (RITUXAN®) 는 비-호지킨 림프종의 치료용으로 승인되었다. B 세포 림프종에 의해 CD20 이 발현되는 경우, 상기 항원은 상기 림프종의 "표적화" 를 위한 후보로서 기능할 수 있다. 본질적으로, 상기 표적화는 하기와 같이 일반화될 수 있다 : B 세포 상의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 환자에 투여함. 이들 항-CD20 항체는 (표면적으로는) 정상 및 악성 B 세포 모두의 CD20 항원에 특이적으로 결합하고, 세포 표면 상의 CD20 에 결합된 항체는 종양성 B 세포의 파괴 및 고갈을 가져올 수 있다. 또한, 화학적 제제, 세포독성제 또는 방사성 제제를 항-CD20 항체에 직접 또는 간접적으로 부착하여, 상기 제제가 CD20 항원을 발현하는 B 세포에 선별적으로 "전달" 되게 할 수 있다. 이러한 두 접근법으로, 일차적 목표는 종양을 파괴하는 것이다. 구체적인 접근법은 사용되는 특정 항-CD20 항체에 따라 상이할 것이다. 따라서, CD20 항원의 표적화의 다양한 접근 방법은 상당히 다양할 수 있음이 명백하다. 리툭시마브 (RITUXAN®) 항체는, 유전적으로 엔지니어링된 키메라성 인간 감마 1 쥐과동물 불변 영역(a genetically engineered chimeric human gamma 1 murine constant domain)을 함유한, 인간 CD20 항원에 대한 단일클론 항체이다. 상기 키메라 항체는 인간 감마 1 불변 영역을 포함하며, IDEC Pharmaceuticals Corporation 에 양도된 미국 특허 번호 5,736,137 (Andersen 등, 1998년 4월 17일 발행) 에서 "C2B8" 이란 명칭으로 분류되었다. RITUXAN® 은 재발성 또는 굴절성(refracting) 저등급 또는 소포성의 CD20 양성 B 세포 비-호지킨 림프종 환자의 치료용으로 승인되었다. 작용 기작에 대한 시험관내 연구는, RITUXAN® 이 인간 보체-의존적 세포독성 (CDC) 을 나타냄을 밝혔다 (Reff 등, Blood 83 (2): 435-445 (1994)). 또한, 이는, 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 을 측정하는 어세이 (assay) 에서 상당한 활성을 나타낸다. RITUXAN® 은, 사이미딘 혼입 어세이에서 항-증식 활성을 지니고 직접 세포자멸사를 유도하는 제한적 능력을 지니는 것으로 (반면 CD20 항체는 그렇지 않음) 나타났다 (Maloney 등, Blood 88 (10): 637a (1996)). 항체의 글리코실화 올리고사카라이드 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 저항성, 면역계와의 상호작용, 약동학, 및 특이적 생물학적 활성을 포함한 치료적 당단백질의 효능과 관계된 특성에 상당한 영향을 줄 수 있다. 상기 특성은 올리고사카라이드의 존부 뿐만 아니라, 이의 특정한 구조에 따라 상이할 수 있다. 올리고사카라이드 구조 및 당단백질 기능 사이에 일부 일반화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 올리고사카라이드 구조는 특정한 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통하여 혈류로부터 당단백질을 빠르게 제거하는 작업을 매개하는 반면, 다른 것은 항체에 결합되어 원치않는 면역 반응을 유발할 수 있다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14 : 975 - 81 (1996)). 포유류 세포는, 단백질을 인간에의 적용을 위한 가장 적합한 형태로 글리코실화하는 그 능력으로 인하여, 치료적 당단백질의 생성을 위한 바람직한 숙주이다 (Cumming 등, Glycobiology 1 :115 - 30 (1991) ; Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14 : 975 - 81 (1996)). 박테리아는 매우 드물게 단백질을 글리코실화하고, 효모, 사상진균류, 곤충 및 식물 세포와 같은 다른 일반적인 유형의 숙주처럼, 혈류로부터의 신속한 제거, 원치 않는 면역 상호 작용, 및 일부 특이한 경우, 생물학적 활성의 감소와 관련된 글리코실화 패턴을 만들어낸다. 포유류 세포 중에서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 지난 이십년간 가장 흔히 사용되어 왔다. 상기 세포는 적절한 글리코실화 패턴을 제공할 뿐만 아니라, 유전적으로 안정적인, 높은 생산성의 클론 세포주의 지속적 생성을 가능하게 한다. 이는, 혈청이-없는 배지를 사용하여 간단한 생물 반응기 (bioreactor) 에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안전하고도 재현가능한 바이오프로세스(bioprocess) 개발을 가능하게 한다. 기타 흔히 사용되는 동물 세포에는 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, NS0- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포가 포함된다. 가장 최근에는, 형질전환 동물로부터의 생성 또한 실험 중이다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol. 14 : 975 - 81 (1996)). 모든 항체는 중쇄 불변 영역의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하고, 각 아이소타입(isotype)이 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 미치는 독특한 배열의 N-연결 탄수화물 구조를 보유한다 (Wright, A., 및 Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 : 26 - 32 (1997)). 부착된 N-연결 탄수화물의 구조는 가공(processing) 정도에 따라 상당히 다양하고, 고(高)-만노스, 다(多)-분지 및 이촉각성(biantennary) 복합 올리고사카라이드를 포함할 수 있다 (Wright, A., 및 Morrison, S. L., Trends Biotech. 15 : 26 - 32 (1997)). 전형적으로, 특정 글리코실화 부위에 부착된 핵심 올리고사카라이드 구조의 균질하지 않은(heterogenous) 가공이 존재하여, 단일클론 항체조차도 다중의 단백당형(glycoform)으로서 존재한다. 마찬가지로, 항체 글리코실화에 있어서 주요한 차이가 세포주 간에 발생하고, 심지어 경미한 차이도 상이한 배양 조건 하에 생장된 소정의 세포주에서 보여지는 것으로 나타났다 (Lifely, M. R. 등, Glycobiology 5(8) : 813 - 22 (1995)). 효능을 크게 증가시키는 한편, 간단한 제조 공정을 유지하면서 심각한, 바람직하지 않은 부작용을 잠재적으로 피할 수 있는 한 방법은, 본원에 그 전체가 참조로서 삽입된 [Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17 : 176 - 180 (1999) 및 미국 특허 번호 6,602,684] 에 기재된 바와 같이 단일클론 항체의 올리고사카라이드 성분을 엔지니어링함으로써 이의 천연, 세포-매개적 효과기 기능을 증강시키는 것이다. 암의 면역요법에서 가장 널리 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는, 각 CH2 도메인의 Asn297 에 보존된 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 두 개의 복합 이촉각성 올리고사카라이드는 CH2 도메인 사이에 파묻혀서, 폴리펩티드 골격과 광범위한 접촉을 형성하고, 이의 존재는 항체가 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 기능을 매개하는 데 필수적이다 (Lifely, M. R., 등, Glycobiology 5 : 813 - 822 (1995) ; Jefferis, R., 등, Immunol Rev. 163 : 59-76(1998) ; Wright, A. 및 Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15 : 26 - 32 (1997)). 본 발명자들은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 내에서의, 이등분된(bisected) 올리고사카라이드의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ ("GnTⅢ") 의 과발현이, 엔지니어링된 CHO 세포에 의해 생성된 항-신경모세포종 키메라성 단일클론 항체 (chCE7) 의 시험관 내 ADCC 활성을 현저히 증가시킴을 이미 밝혀낸 바 있다 (Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999); 및 국제공개번호 WO 99/54342 참조, 전체 내용이 본원에 인용 포함됨). chCE7 항체는, 높은 종양 친화성 및 특이성을 갖지만 GnTⅢ 효소가 결핍된 표준 산업적 세포주에서 생성될 경우 임상적으로 유용할 가능성이 극히 미미한 비콘쥬게이션 mAb 의 큰 클래스(large class)에 속한다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). 상기 연구는, 항체-생성 세포가 GnTⅢ 을 발현하도록 엔지니어링하여, 이것이 이등분된 비푸코실화 (nonfucosylated) 올리고사카라이드를 포함하는, 불변 영역 (Fc) 과 결합된 이등분된 올리고사카라이드의 비율을 천연-발생의 항체에서 발견되는 수준보다 높게 증가시키도록 함으로써 ADCC 활성을 상당히 증가시킬 수 있음을 처음으로 제시하였다. 인간을 포함하는 (그러나 이에 한정되지 않음) 영장류에 있어서 B 세포 림프종의 치료를 위하여 CD20 항원을 표적화하는 강화된 치료적 접근법에 대한 요구가 상존한다.