저장 안정성 바이러스 및 이의 면역원성 조성물의 제조방법 document_id A220623042723

파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 패밀리 일원인 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 파라인플루엔자 바이러스(PIV)는 유아 및 어린이의 중증 호흡기 질환에 관여하는 주요 병원체이다(Glezen et al., 1981; Chanock et al., 1992; Martin et al., 1978). RSV의 두 그룹인 그룹 A(RSV-A) 및 그룹 B(RSV-B)는 해마다 겨울 유행병중에 동시에 유포되나, 보통 그룹 A 감염이 우세한 것으로 보여진다(McConnochie et al., 1990; Stark et al., 1991). PIV 3형(PIV-3)은 세기관지염, 폐렴 및 크룹(croup)의 공통 원인이다. RSV 및 PIV-3은 합해서 모든 유아 및 어린이 기도 질환 입원환자의 최대 30%를 차지한다(Crowe, 1995). PIV 형 1 및 2(PIV-1 및 PIV-2)가 또한 크룹의 공통 원인이다. RSV는 또한 면역계가 손상된 사람 및 노인에게서 상당한 이환률을 야기하는 것으로 보고되었다. 매년 전세계적으로 6천 5백만 정도가 RSV에 감염되어 그 중 160,000명이 사망에 이르게 된다(Robbins and Freeman, 1988). 미국에서만, RSV 감염으로 인해 매년 100,000명의 어린이가 중증 폐렴 및 세기관지염으로 입원하고 있는 실정이다(Glezen et al., 1986; Katz, 1985). 미국에서 RSV 감염으로 입원 및 외래진료를 받고 있는 어린이로 인해 1992년에만 3억 4천만 달러가 넘게 지출되었다(Wertz and Sullender, 1992). 세계보건기구(WHO)(Crowe, 1995) 및 앨러지 및 전염병 연구소(NIAID) 백신 자문 위원회에 따르면 백신 개발에 HIV 다음으로 RSV가 차지하였고, 효능있는 PIV(예: PIV 3형) 백신 제조가 백신 개발에 우선적으로 고려되는 상위 10위내 백신으로 랭크되었다. 따라서, 유아, 어린이, 노인 및 면역이 손상된 사람에서 중증 호흡기 질환을 예방할 수 있는 안전하고 유효한 RSV 및/또는 PIV 백신이 절실히 요구되고 있다. 호흡기 질환을 제어하기 위하여 생 약독화 RSV 및/또는 PIV를 사용하는 것이 보다 유망한 해결방법 중 하나이다. 지난 20년간 다수의 생 약독화 RSV 균주가 개발되어 RSV-혈청음성반응 어린이에 시험되었다. RSV 생 약독화의 가장 유망한 방법은 cp(cold-passaged) RSV, 온도-민감(ts) RSV 돌연변이 및 cp 온도 민감(cpts) RSV 돌연변이체이다(Kneyber and Kimpen, 2002). RSV 돌연변이체, 예컨대 cpts-248, cpts-248/404, cpts-530 및 PIV-3 돌연변이체 cp-45는 현재 실험실에서 평가 및 임상 시험 중에 있다. 효능있는 생 약독화 RSV, PIV 또는 RSV/PIV 복합 면역원성 조성물의 동정 및 개발 이외에도, 현재 저장 안정성 RSV 및/또는 PIV 조성물 및 이의 면역원성 조성물의 제조 방법이 요망되고 있다. 예를 들어, RSV는 -65℃ 내지 -86℃에서 저장하는 동안 3개월 내에 불활성화되는 열에 불안정한 바이러스이다(Hambling, 1964; Wulff et al., 1964; Gupta et al., 1996). 따라서, 저장 안정성 RSV, PIV 또는 RSV/PIV 면역원성 조성물이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 또한, 다른 바이러스 면역원성 조성물의 저장 안정성을 증대시키는 것은 세계적인 건강에 백신이 미치는 영향을 향상시키는 데 중요한 목표인 것으로 인식되어온 지 오래이다(Melnick and Wallis, 1963; Rasmussen et al., 1973; Ayra, 2001; Hilleman, 1989; Lemon and Milstein, 1994). 따라서, 바이러스 제제 및 공정 업계에서는 단순 허피스 바이러스, 거대세포 바이러스, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 수두 대상포진 바이러스, 멈프스 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 폴리오 바이러스(poliovirus), 리노 바이러스, 아데노 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 노워크 바이러스(Norwalk virus), 토가 바이러스, 알파 바이러스, 풍진 바이러스, 광견병 바이러스, 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 메타뉴모 바이러스(metapneumovirus), 코로나 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 등과 같은 저장 안정성 바이러스 조성물의 제조 방법을 개발할 필요성을 인식하고 있다. 발명의 요약 본 발명은 일반적으로 저장 안정성 바이러스 조성물 및 이의 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 특정 구체예로, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 또는 이들의 복합물을 포함하는 저장 안정성 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 동결건조된 고형 조성물 또는 동결 액체 조성물로서 저장 안정성이 있는 저장 안정성 바이러스 조성물을 제공하는 하나 이상의 제제 및 공정 단계에 관한 것이다. 특정 일례로, 본 발명은 동결건조된 고형 조성물 또는 동결 액체 조성물로서 저장 안정성이 있는 저장 안정성 RSV, PIV 또는 RSV/PIV 조성물을 제공하는 하나 이상의 제제 및 공정 단계에 관한 것이다. 따라서, 특정 예로, 본 발명은 소용량 저장 안정성 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 특정 일례로, 본 발명은 (a) 바이러스 조성물을 약 60 분 이하의 시간 내에 이의 유리 전이 온도 이하로 동결시키고, (b) 바이러스 조성물을 동결건조시키는 단계를 포함하며, 동결건조된 바이러스 조성물이 약 1℃ 내지 약 10℃의 저장 온도에서 적어도 1 년간 안정한 것을 특징으로 하는, RSV, PIV 또는 이의 복합물을 포함하는 소용량 저장 안정성 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 일례로, 유리 전이 온도는 약 -45℃이며, 약 60 분 이하의 시간 내에 도달한다. 다른 예로, 유리 전이 온도는 약 -35℃이며, 약 40 분 이하의 시간 내에 도달한다. 또 다른 예로, 유리 전이 온도는 약 -35℃이며, 약 20 분 이하의 시간 내에 도달한다. 일례로, 바이러스 조성물의 용량은 약 0.2 ㎖ 내지 약 1.0 ㎖이다. 특정 예로, 바이러스 조성물은 적합한 컨테이너 수단 내에 포함되며, 여기에서 컨테이너 수단은 바이얼, 튜브 또는 비강내 스프레이 장치로 추가로 한정된다. 일례로, RSV는 그룹 A RSV(RSV-A), 그룹 B RSV(RSV-B) 또는 각 그룹 A 및 B의 하나 이상의 항원을 포함하는 키메라 재조합체 RSV(RSV-AB)로 추가로 한정되며, PIV는 PIV 1형(PIV-1), PIV 2형(PIV-2) 또는 PIV 3형(PIV-3)으로 추가로 한정된다. 특정 구체예로, 소용량 저장 안정성 바이러스 조성물은 나트륨 및/또는 칼륨 일염기 및 이염기 염을 포함하고 pH 약 6.5 내지 약 7.8인 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액에서 제제화된다. 다른 예로, 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 N-2-하이드록시에틸피페라진-N''-2-에탄설폰산(HEPES)을 추가로 포함한다. 다른 특정예로, 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 추가로 포함한다. 특정 구체예로, 소용량 저장 안정성 바이러스 조성물은 나트륨 및/또는 칼륨 일염기 및 이염기 염을 포함하고 pH 약 6.5 내지 약 7.8인 10 mM 포스페이트 완충 용액에서 제제화된다. 다른 예로, 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES를 추가로 포함한다. 다른 특정 예로, 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 추가로 포함한다. 일례로, 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액(pH 약 6.5 내지 약 7.8)은 수크로스, L(+)-글루탐산, L(+)-글루탐산 모노나트륨 염, L(+)-글루탐산과 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염의 혼합물, 인간 알부민(HA) 및/또는 소이 펩톤을 추가로 포함한다. 다른 예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물 및 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA를 추가로 포함한다. 또 다른 예로, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA는 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤으로 대체된다. 그밖의 또 다른 예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘, 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0g/ℓ의 HA 및 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤을 포함한다. 일례로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 0.25 mM 내지 약 12.5 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물 및 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA를 추가로 포함한다. 다른 예로, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA는 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤으로 대체된다. 또 다른 예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.25 mM 내지 약 12.5 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM의 염화마그네슘, 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM의 염화칼슘, 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 약 2.45 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 2.45 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA 및 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤을 포함한다. 일례로, 소용량 저장 안정성 바이러스 조성물의 저장 온도는 약 5℃이다. 다른 특정 예로, 바이러스 조성물은 약 1℃ 내지 약 10℃에서 1 년간 저장 후 약 1.0 log PFU 미만의 PFU 감소를 나타낸다. 다른 구체예로, 바이러스 조성물은 약 1℃ 내지 약 10℃에서 1 년간 저장 후 0.2 ㎖당 적어도 약 4.0 log PFU를 나타낸다. 일례로, 바이러스 조성물의 동결건조는 (a) 약 0.5 ㎖ 내지 0.6 ㎖의 바이러스 조성물을 바이얼에 투입하여 약 5℃의 온도로 냉각시키고; (b) 바이얼을 동결건조 셸프(lyophilization shelf) 상에 위치시켜 셸프 온도를 분당 약 -1.0℃ 내지 분당 약 -2.0℃의 속도로 5℃에서 -50℃로 감소시킨 후; (c) 셸프 온도를 약 -50℃에서 60 분 동안 유지시키며; (d) 동결건조 챔버 압력을 0.10 토르로 감소시키고, 셸프 온도를 약 -50℃에서 30～60 분 동안 유지시킨 다음; (e) 셸프 온도를 약 0.10 토르에서 분당 약 1.0℃ 내지 약 2.0℃의 속도로 -50℃에서 0℃로 증가시키고, 셸프 온도를 약 0℃에서 약 540 분 내지 약 720 분 동안 유지시키며; (f) 셸프 온도를 약 0.10 토르에서 분당 약 0.5℃의 속도로 0℃에서 15℃로 증가시키고, 셸프 온도를 약 15℃에서 약 600 분 내지 약 720 분 동안 유지시키고; (g) 바이얼에 질소 가스를 충전하여 이를 기밀 밀봉(hermetically sealing)하는 단계로 추가로 한정된다. 다른 구체예로, 바이러스 조성물의 동결건조는 (a) 약 0.5 ㎖ 내지 0.6 ㎖의 바이러스 조성물을 바이얼에 투입하여 약 5℃의 온도로 냉각시키고; (b) 동결건조 셸프를 약 -70℃의 온도로 동결시킨 후; (c) 바이얼을 동결건조 셸프 상에 위치시켜 온도를 약 -70℃에서 약 60 분 동안 유지시키며; (d) 동결건조 챔버 압력을 0.10 토르로 감소시키고, 셸프 온도를 분당 약 1.0℃의 속도로 약 -70℃에서 -50℃로 증가시킨 다음; (e) 셸프 온도를 약 0.10 토르에서 분당 약 1.0℃ 내지 약 2.0℃의 속도로 -50℃에서 0℃로 증가시키고, 셸프 온도를 약 0℃에서 약 540 분 내지 약 720 분 동안 유지시키며; (f) 셸프 온도를 약 0.10 토르에서 분당 약 0.5℃의 속도로 0℃에서 15℃로 증가시키고, 셸프 온도를 약 15℃에서 약 600 분 내지 약 720 분 동안 유지시키고; (g) 바이얼에 질소 가스를 충전하여 이를 기밀 밀봉하는 단계로 추가로 한정된다. 또 다른 구체예로, 본 발명은 대용량(대량)의 동결건조 안정성 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 특정예로, 본 발명은 (a) 적어도 50 ㎖ 용량의 액체 바이러스 조성물을 동결건조 트레이에 위치시키고; (b) 바이러스 조성물을 액체 질소 배쓰에서 적어도 20 분 동안 동결시킨 후; (c) 바이러스 조성물을 동결건조시키는 단계를 포함하며, 동결건조된 바이러스 조성물이 동결건조 전 바이러스 조성물에 대해 약 0.5 log PFU 미만의 PFU 감소를 특징으로 하는, RSV, PIV 또는 이의 복합물을 포함하는 대용량(또는 대량)의 동결건조 안정성 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예로, 대용량 바이러스 조성물은 동결건조 후 투여당 적어도 5.0 log PFU를 나타낸다. 일례로, 유리 전이 온도는 약 -35℃이다. 다른 예로, 유리 전이 온도는 약 -30℃ 내지 약 -40℃이다. 또 다른 예로, 동결건조 트레이는 Lyoguard® 동결건조 트레이(W.L. Gore and Associates; Newark, DE)이다. 일례로, 대용량의 바이러스 조성물은 동결건조 트레이당 적어도 500 ㎖이다. 다른 예로, 대용량의 바이러스 조성물은 동결건조 트레이당 적어도 1000 ㎖이다. 일례로, RSV는 RSV-A, RSV-B 또는 각 그룹 A 및 B의 하나 이상의 항원을 포함하는 키메라 재조합체 RSV(RSV-AB)로 한정되며, PIV는 PIV-1, PIV-2 또는 PIV-3으로 추가로 한정된다. 일례로, 대용량 바이러스 조성물은 나트륨 및/또는 칼륨 일염기 및 이염기 염을 포함하고, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액에서 제제화된다. 다른 예로, 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 2.5 mM 내지 약 25 mM의 HEPES를 추가로 포함한다. 다른 특정 예로, 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 추가로 포함한다. 특정 구체예로, 대용량 바이러스 조성물은 나트륨 및/또는 칼륨 일염기 및 이염기 염을 포함하고, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 10 mM 포스페이트 완충 용액에서 제제화된다. 다른 예로, 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 2.5 mM 내지 약 25 mM의 HEPES를 추가로 포함한다. 다른 특정 예로, 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0. 1 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 추가로 포함한다. 일례로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 2.5 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 수크로스, L(+)-글루탐산, L(+)-글루탐산 모노나트륨 염, L(+)-글루탐산과 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염의 혼합물, 인간 알부민(HA) 및/또는 소이 펩톤을 추가로 포함한다. 다른 예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 2.5 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물 및 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA를 추가로 포함한다. 일례로, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA는 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤으로 대체된다. 다른 예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 2.5 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘, 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA 및 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤을 포함한다. 또 다른 구체예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 2.5 mM 내지 약 12.5 mM의 HEPES, 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM의 염화마그네슘 및 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 2.45 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 2.45 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물 및 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA를 추가로 포함한다. 다른 구체예로, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA는 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤으로 대체된다. 또 다른 구체예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 2.5 mM 내지 약 12.5 mM의 HEPES, 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM의 염화마그네슘, 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM의 염화칼슘, 약 50 g/ℓ의 수크로스, 약 0.049 mM 내지 2.45 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 0.049 mM 내지 약 2.45 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물, 약 1.0 g/ℓ 내지 약 10.0 g/ℓ의 HA 및 약 50 g/ℓ의 소이 펩톤을 포함한다. 다른 특정 예로, 대용량 바이러스 조성물의 동결건조는 (a) 약 -50℃의 온도에서 동결된 바이러스 조성물을 포함하는 동결건조 트레이를 약 -50℃의 온도로 예냉시킨 동결건조 셸프 상에 위치시켜 온도를 약 60 분간 유지하고; (b) 챔버 압력을 0.10 토르로 감소시키고, 셸프 온도를 약 0.10 토르에서 분당 약 0.23℃의 속도로 -50℃에서 -23℃로 증가시킨 후; (c) 셸프 온도를 약 -23℃에서 약 80 시간 내지 약 100 시간 동안 유지시키며; (d) 동결건조 챔버 압력을 0.02 토르로 감소시키고, 셸프 온도를 분당 약 0.23℃의 속도로 -23℃에서 15℃로 증가시키고; (e) 셸프 온도를 약 0.02 토르에서 약 15℃로 약 30 시간 내지 약 40 시간 동안 유지시킨 다음; (f) 셸프 온도를 0.02 토르에서 분당 약 0.17℃의 속도로 15℃에서 25℃로 증가시키며; (g) 셸프 온도를 약 0.02 토르에서 약 25℃로 약 10 시간 동안 유지시키고; (h) 챔버에 질소 가스를 충전하고 트레이를 질소 가스 하에서 알루미늄 파우치에 기밀 밀봉하는 단계로 추가로 한정된다. 다른 특정 예로, 대용량 바이러스 조성물의 동결건조는 (a) 약 -70℃의 온도에서 동결된 바이러스 조성물을 포함하는 동결건조 트레이를 약 -70℃의 온도로 예냉시킨 동결건조 셸프 상에 위치시켜 온도를 약 60 분간 유지하고; (b) 챔버 압력을 0.10 토르로 감소시키고, 셸프 온도를 분당 약 0.23℃의 속도로 -70℃에서 -23℃로 증가시킨 후; (c) 셸프 온도를 약 0.10 토르에서 약 -23℃로 약 80 시간 내지 약 100 시간 동안 유지시키며; (d) 챔버 압력을 0.02 토르로 감소시키고, 셸프 온도를 분당 약 0.23℃의 속도로 -23℃에서 15℃로 증가시키고; (e) 온도를 0.02 토르에서 약 15℃로 약 30 시간 내지 40 시간 동안 유지시킨 다음; (f) 셸프 온도를 0.02 토르에서 분당 약 0.17℃의 속도로 15℃에서 25℃로 증가시키며; (g) 온도를 약 25℃에서 약 10 시간 동안 유지시키고; (h) 챔버에 질소 가스를 충전하고 트레이를 질소 가스 하에서 알루미늄 파우치에 기밀 밀봉하는 단계로 추가로 한정된다. 또 다른 구체예로, 본 발명은 저장 안정성 동결 액체 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 특정예로, 본 발명은 (a) 금속 플레이트를 액체 질소 배쓰에서 평형화시키고; (b) 액체 바이러스 조성물을 적합한 컨테이너 수단에 위치시킨 후; (c) 단계 (b)의 컨테이너를 금속 홀더에 삽입하며; (d) 금속 홀더를 단계 (a)의 평형화 금속 플레이트에 약 10 분간 놓아둔 다음; (e) 금속 홀더로부터 컨테이너를 제거하며; (f) 컨테이너를 약 -20℃ 내지 약 -70℃의 온도에서 저장하는 단계를 포함하며, 단계 (a) 내지 (f)후 바이러스 조성물이 6 개월간 저장 후 약 0.5 log PFU 미만의 PFU 감소를 특징으로 하는, RSV, PIV 또는 이의 복합물을 포함하는 저장 안정성 동결 액체 바이러스 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 특정 구체예로, 컨테이너 수단은 비강내 스프레이 장치이다. 일례로, 비강내 스프레이 장치는 BD AccusprayTM 비강내 스프레이 장치(BD Medical Pharmaceutical Systems; Franklin Lakes, NJ)이다. 다른 구체예로, 금속 홀더는 알루미늄이다. 또 다른 구체예로, 금속 홀더는 스테인레스강이다. 다른 예로, 바이러스 조성물은 단계 (a) 내지 (f)후 적어도 4.0 log PFU/0.2 ㎖를 나타낸다. 또 다른 구체예로, 바이러스 조성물은 -20℃의 온도에서 6개월간 저장 후 적어도 4.0 log PFU/0.2 ㎖를 나타낸다. 다른 예로, 바이러스 조성물은 -70℃의 온도에서 6개월간 저장 후 적어도 4.0 log PFU/0.2 ㎖를 나타낸다. 특정 구체예로, 액체 바이러스 조성물은 단백질 안정화제의 부재하에 제제화된다. 일례로, RSV는 RSV-A, RSV-B 또는 각 그룹 A 및 B의 하나 이상의 항원을 포함하는 키메라 재조합체 RSV(RSV-AB)로 한정되며, PIV는 PIV-1, PIV-2 또는 PIV-3으로 추가로 한정된다. 다른 특정 예로, 액체 바이러스 조성물은 나트륨 및/또는 칼륨 일염기 및 이염기 염을 포함하고 pH 약 6.5 내지 약 7.8인 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액에서 제제화된다. 다른 예로, 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES를 추가로 포함한다. 다른 특정 예로, 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 추가로 포함한다. 특정 구체예로, 액체 바이러스 조성물은 나트륨 및/또는 칼륨 일염기 및 이염기 염을 포함하고, pH 약 6.5 내지 약 7.8인 10 mM 포스페이트 완충 용액에서 제제화된다. 다른 예로, 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES를 추가로 포함한다. 다른 특정 예로, 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 추가로 포함한다. 일례로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 수크로스 및 L(+)-글루탐산, L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함한다. 다른 예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 5.0 mM 내지 약 20 mM 포스페이트 완충 용액은 약 75 g/ℓ의 수크로스 및 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산과 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염의 혼합물을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예로, pH 약 6.5 내지 약 7.8이고, 약 0.25 mM 내지 약 25 mM의 HEPES, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화마그네슘 및 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충 용액은 약 75 g/ℓ의 수크로스 및 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 또는 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염 또는 약 4.9 mM의 L(+)-글루탐산과 L(+)-글루탐산 모노나트륨 염의 혼합물을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예로, 본 발명은 바이러스 조성물을 약 60 분 이하 동안 이의 유리 전이 온도 이하로 동결시키고, 바이러스 조성물을 동결건조시키는 방법에 따라 제조된, 약 1℃ 내지 약 10℃의 저장 온도에서 적어도 1 년 동안 안정한 동결건조된 소용량 저장 안정성 바이러스 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구체예로, 본 발명은 적어도 50 ㎖ 용량의 액체 바이러스 조성물을 동결건조 트레이에 위치시키고; 바이러스 조성물을 액체 질소 배쓰에서 적어도 약 20 분 동안 이의 유리 전이 온도 이하로 동결시킨 후; 바이러스 조성물을 동결건조시키는 방법에 따라 제조된, 동결건조 전 바이러스 조성물에 대해 약 5.0 log PFU 미만의 PFU 감소를 나타내는 동결건조된 대용량의 저장 안정성 바이러스 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구체예로, 본 발명은 (a) 금속 플레이트를 액체 질소 배쓰에서 평형화시키고; (b) 액체 바이러스 조성물을 적합한 컨테이너 수단에 위치시킨 후; (c) 단계 (b)의 컨테이너를 금속 홀더에 삽입하며; (d) 금속 홀더를 단계 (a)의 평형화 금속 플레이트에 약 10 분간 놓아둔 다음; (e) 금속 홀더로부터 컨테이너를 제거하며; (f) 컨테이너를 약 -20℃ 내지 약 -70℃의 온도에서 저장하는 방법에 따라 제조된, 단계 (a) 내지 (f)후 바이러스 조성물이 6 개월간 저장 후 약 0.5 log PFU 미만의 PFU 감소를 나타내는 저장 안정성 동결 액체 바이러스 조성물에 관한 것이다. 다른 특정 구체예로, 본 발명은 본 발명의 동결건조법에 따라 제조된 바이러스 조성물을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기에서 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체에 용해, 희석 또는 현탁된다. 다른 구체예로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 동결 액체 바이러스 조성물을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명, 이의 바람직한 구체예 및 청구범위로부터 알 수 있을 것이다.