2-미크론 패밀리 플라스미드 및 이의 용도 document_id A220623042785

버딩 이스트와 매우 근접한 특정 관련 종들은 자연적으로 발생하는 환형 이중 스트랜드 DNA 플라스미드를 함유하는 것으로 알려져 있다. 총괄하여 2㎛-패밀리 플라스미드라고 칭하여지는 이러한 플리스미드는 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii)(이전에는 지고사카로미세스 비스포러스(Zygosaccharomyces bisporus)로 분류됨))의 pSR1, pSB3 및 pSB4, 지고사카로미세스 베일리(Zygosaccharomyces bailii)의 플라스미드 pSB1 및 pSB2, 지고사카로미세스 퍼멘타티(Zygosaccharomyces fermentati)의 플라스미드 pSM1, 클루이베로미세스 드로스필라럼(Kluyveromyces drosphilarum)의 플라스미드 pKD1, 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens)(이후 "pPM1"이라 칭함)의 무명의 플라스미드 및 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)(Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews, 53 , 299; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology, 56 , 331) 및 S. 칼스버제네시스(S. carlsbergenesis)와 같은 다른 사카로미세스종의 2㎛ 플라스미드 및 변이체(Scp1, Scp2 및 Scp3와 같은)를 포함한다. 플라스미드의 패밀리로서 이러한 분자들은 이들이 플라스미드의 반대편상에 두개의 역위 반복을 소유하며, 약 6-kbp(4757-6615-bp 범위)의 유사한 크기, 적어도 3개의 오픈 리딩 프래임(이중 하나는 사이트 스페시픽 리콤비나아제(2㎛의 FLP와 같은)를 암호함) 및 역위 반복의 한쪽 말단에 근접하게 위치한 복제 오리진(ori)으로도 알려진 자가 복제 서열(ARS)을 갖는 점에서 일련의 공통된 특징을 공유한다(Futcher, 1988, Yeast, 4 , 27; Murray et al., 1988, J. Mol. Biol. 200 , 601 및 Toh-e et al., 1986, Basic Life Sci. 40 , 425). 식별가능한 DNA 서열 상동성의 결여에도 불구하고, 이들의 공유된 분자적 구조 및 오픈 리딩 프래임의 기능 보존성은 패밀리 멤버들 간의 공통 관련성을 입증한다. 2㎛ 플라스미드(도 1)는 반수체 게놈당 60-100카피에서 대부분의 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 스트레인에 내인성인 6,318-bp 이중-스트랜드 DNA 플라스미드이다. 2㎛ 플라스미드는 두개의 599-bp 역위 반복 서열에 의해 분리된 스몰 유니크(US) 리전 및 라지 유니크(UL) 리전을 포함한다. 역위 반복 서열의 자리-특이 재조합은 생체내에서(in vivo) 플라스미드의 A-형 및 B-형간의 인터-컨버전을 일으킨다(Volkert 0026# Brach, 1986, Cell, 46 , 541). 상기 두 형태의 2㎛는 이들의 독특한 리전의 상대적 방향만 다르다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 클로닝된 2㎛ 플라스미드(Scp1으로도 알려짐)의 DNA 시퀀싱 결과, 6,318-bp의 크기를 나타내나(Hartely 및 Doneloson, 1980, Nature, 286 , 860), 2㎛, Scp2 및 Scp3의 다른 약간 보다 작은 변이체들은 125-bp 및 220-bp의 소 결실의 결과로 각각 STB로 알려진 리전에 존재하는 것으로 알려져 있다(Cameron et al., 1977, Nucl. Acids Res., 4, 1429: Kikuchi, 1983, Cell, 35 , 487 및 Livingston 0026# Hahne, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 , 3727). 한 연구에서 전 세계의 약 80%의 자연 사카로미세스 스트레인이 2㎛에 대해 DNA 상동성을 가졌다(서던 블롯 분석시)(Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunobiology, 96 , 119). 또한, 변이(유전적 폴리모피즘)가 에스. 세레비지아에 및 에스. 칼스버제네시스에서 발견되는 2㎛ 플라스미드의 자연 집단내에서 발생하며, NCBI 서열(가입 번호 NC_001398)이 그 일 예이다. 2㎛ 플라스미드는 핵 국소화를 가지며 고수준의 유사분열 안정성을 나타낸다(Mead et al., 1986, Molecular 0026# General Genetics, 205 , 417). 2㎛ 플라스미드의 고유 안정성은 플라스미드-암호화 카피 수 증폭 및 키메릭 벡터의 발달도중 쉽게 손상되는 파티셔닝 메카니즘에 기인한다(Futcher 0026# Cox, 1984, J. Bacteriol., 157 , 283; Bachmair 0026# Ruis, 1984, Monatshefte fur Chemie, 115 , 1229). 2㎛ 플라스미드를 함유하는 이스트 스트레인은 [cir+]로 알려져 있으며, 2㎛ 플라스미드를 함유하지 않는 이스트 스트레인은 [cir0]으로 알려져 있다. US-리전은 REP2 및 FLP 유전자를 함유하며, UL-리전은 REP1 및 D(RAF로도 알려짐) 유전자, STB-로커스 및 복제 오리진을 함유한다(Broach 0026# Hicks, 1980, Cell, 21 , 501; Sutton 0026# Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5 , 2770). Flp 리콤비나아제는 역위 반복내의 FRT-사이트(Flp 인지 표적)에 바인딩하여 자리-특이 재조합을 매개하며, 이는 생체내에서 자연 플라스미드 증폭 및 플라스미드 복제수의 조절에 필수적이다(Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82 , 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 5875). 2㎛-패밀리 플라스미드의 복제수는 Flp 리콤비나아제 활성의 변화에 의해 현저히 영향받을 수 있다(Sleep et al, 2001, Yeast, 18 , 403; Rose 0026# Broach, 1990, Methods Enzymol., 185 , 234). Rep1 및 Rep2 단백질은 플라스미드 분리를 매개하나 그 작용 모드는 불분명하다(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183 , 2306). 이들은 또한 FLP 유전자의 전사를 억제한다(Reynolds et al, 1987, Mol. Cell. Biol., 7 , 3566). FLP 및 REP2 유전자는 명확하게 이들간에 규정된 개재 서열없이 발산성 프로모터로부터 전사된다. FLP 및 REP2 전사는 이들의 번역 종결 코돈이후에 각각 24-bp 및 178-bp에서 모두 역위 반복 서열내의 동일한 서열 모티프에서 종결된다(Sutton 0026# Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5 , 2770). FLP의 경우, C-말단 암호 서열이 또한 역위 반복 서열내에 놓여진다. 또한, 상기 두 역위 반복 서열은 599-bp에 걸쳐 매우 보존적이며, 이는 시험관내에서 FRT-사이트(65-bp미만)만이 자리-특이 재조합에 필수적임에도 불구하고 생체내에서 효율적인 플라스미드 복제 및 증폭에 유리한 것으로 간주되는 특징이다(Senecoff et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82 , 7270; Jayaram, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 5875; Meyer-Leon et al, 1984, Cold spring Harbor Symposia On Quantitative Biology, 49, 797). Flp의 중요 촉매 잔기는 히스티딘-309 및 히스티딘 345에 의해 촉진되는 스트랜드-컷팅을 갖는 아르기닌-308 및 티로신-343(필수적임)이다(Prasad et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 2189; Chen et al, 1992, Cell, 69, 647; Grainge et al, 2001, J. Mol. Biol., 314, 717). 두개의 작용 도메인이 Rep2에 표시된다. 잔기 15-58은 Rep1-바인딩 도메인을 형성하며, 잔기 59-296은 자가-결합 및 STB-바인딩 리전을 함유한다(Sengupta et al, 2001, J. Bacteriol., 183 , 2306). 2㎛ 플라스미드의 다수의 필수 작용 리전이 결여되어 있으나 작용성 cis 엘레멘트 ARS 및 STB를 보유하는 2㎛의 키메릭 혹은 대 결실 돌연변이 유도체는 세포분열시 모세포와 딸세포간의 분할을 효율적으로 할 수 없다. 이러한 플라스미드는 만일 이러한 작용이 트랜스로 제공되는 경우 예를 들어, 소위 [cir+] 숙주라고 불리우는 숙주내 작용성 2㎛ 플라스미드의 공급에 의해 역시 그러할 수 있다. 관심있는 유전자는 미리 2㎛ 플라스미드의 UL-리전내로 삽입된 바 있다. 예를 들어, EP 0 286 424의 플라스미드 pSAC3U1을 참조바란다. 그러나, US 리전과 UL 리전사이에 과도한 비대칭을 생성하지 않고 2㎛ 플라스미드의 UL-리전내로 유용하게 삽입될 수 있는 DNA의 양에는 한계가 있기 쉽다. 따라서, 2㎛ 플라스미드의 US-리전은 DNA 프레그먼트의 길이를 역위 반복의 한쪽 사이드와 동등하게 하는 경향이 있어 특히 부가적인 DNA 서열의 삽입에 매우 매력적이다. 이는 도 2에 나타낸 바와 같이, 플라스미드가 이미 이스트 선별 마커와 인접 DNA 서열의 도입에 의해 채워지는 발현 벡터용인 경우에 특히 그러하다. 예를 들어, 도 2에 나타낸 플라스미드는 β-락타마아제 유전자(앰피실린 저항성), LEU2 선별 마커 및 올리고뉴클레오타이드 링커를 포함하며, 여기서 후자 둘은 2㎛-패밀리 디스인테그레이션 벡터, pSAC3(참조 EP 0 286 424)의 UL-리전내의 유일한 SnaBI-사이트내로 삽입된다. 앰피실린 저항성 유전자를 함유하는 XbaI-사이트사이의 E.coli DNA는 이스트내로 형질변형된 후 도 2에 나타낸 바와 같은 플라스미드로부터 소실된다. 이는 Chinery 0026# Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16, 21 및 EP 0 286 424에 기술되어 있으며, 여기서 이러한 타입의 벡터는 "디스인테그레이션 벡터"로 명명된다. 도 2에 나타낸 혼잡한 상태에서, 추가의 폴리뉴클레오타이드 삽입이 이루어질 수 있는지는 쉽게 식별되지 않는다. 링커내의 NotI-사이트는 부가적인 DNA 프레그먼트의 삽입용으로 사용되어 왔지만, 이는 UL 리전과 US 리전사이의 추가적인 비대칭에 기여한다(Sleep et al, 1991, Biotechnology(NY), 9 , 183). 본 출원인은 이미 부가적인 DNA를 2㎛ 플라스미드내로 삽입하고 이의 높은 고유 플라스미드 안정성을 유지시키는 것을 시도하였다. 2㎛-패밀리 디스인테그레이션 플라스미드 pSAC300에서, URA3 유전자를 함유하는 1.1-kb DNA 프레그먼트는 URA3 유전자로부터의 전사가 REP2 전사와 같은 방향이 되는 식으로 US-리전내의 REP2와 FLP사이의 EagI-사이트내로 삽입되었다(참조 EP 0 286 424). S150-2B[cir0]은 pSAC300에 의해 우라실 독립영양성으로 형질변형되었으며, 이는 2㎛의 UL-리전내로 삽입된 URA3를 갖는 유사한 벡터보다 상당히 덜 안정적(30세대에서 50% 플라스미드 소실)인 것으로 나타났다(30세대에서 0-10% 플라스미드 소실)(Chinery 0026# Hinchliffe, 1989, Curr. Genet., 16 , 21; EP 0 286 424). 따라서, EagI 사이트에서의 삽입은 FLP 발현을 저해할 수 있으며, 삽입 위치는 그 결과물인 플라스미드의 안정성에 대한 깊은 영향을 미칠 수 있다는 결론이 얻어졌으며, 이는 Bijvoet et al., 1991, Yeast, 7 , 347에 의해 확인된 결론이다. 2㎛-패밀리 플라스미드내로 추가 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 숙주 유래 단백질, 재조합 단백질, 또는 비-암호 안티센스 또는 RNA 저해(RNAi) 전사체를 암호하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입이 바람직할 수 있다. 더욱이, 2㎛-패밀리 플라스미드내로 다중의 추가 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하여, 이에 따라 예를 들어, 다중의 개별적으로 암호화된 다중-서브유니트 단백질, 동일한 대사 경로의 다른 멤버, 부가적인 선별 마커 또는 재조합 단백질(단일 또는 다중-서브유니트) 및 재조합 단백질의 발현을 돕는 샤프롱을 암호하는 플라스미드를 제공하는 것이 바람직하다. 그러나, 6,318-bp 2㎛ 플라스미드, 및 다른 2㎛-패밀리 플라스미드는 작용성 유전적 엘레멘트로 혼잡하게 되며(Sutton 0026# Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 2770; Broach et al, 1979, Cell, 16, 827), 플라스미드 안정성에 수반된 손실없이 부가 DNA 서열의 삽입을 위해 존재하는 분명한 위치를 갖지 않는다. 실제로, 복제 오리진 및 D 유전자 로커스사이의 리전을 제외하고, 전체 2㎛ 플라스미드 게놈은 적어도 하나의 폴리(A)+ 종내로 전사되며, 종종 하나 이상의 폴리(A)+ 종내로 전사된다(Sutton 0026# Broach, 1985, Mol. Cell. Biol., 5 , 2770). 결과적으로, 대부분의 삽입은 생체내에서 플라스미드 기능에 유해한 영향을 미칠 것으로 예측된다. 실제로, 당 기술분야의 숙련자는 2㎛-패밀리 플라스미드내로 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 것에 대해 포기하였다. Robinson et al, 1994, Bio/Technology, 12 , 381-384는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 부가 PDI 유전자 복제물이 사람 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) B 동종이량체의 재조합 발현을 10배 증가시키고 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosacharomyces pombe) 산 포스파타아제의 발현을 4배 증가시키는데 사용될 수 있음을 보고하였다. Robinson은 부가적인 염색체 통합 PDI 유전자 복제물을 이용하여 PDGF 및 S. 폼베 산 포스파타아제의 발현이 증가되는 것을 관찰하였다. Robinson은 다중-복제 2㎛ 발현 벡터를 사용하여 PDI 단백질 수준을 증가시키려는 시도는 이종 단백질 분비에 유해한 영향을 미친다고 보고하였다. Shusta et al, 1998, Nature Biotechnology, 16 , 773-777은 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 단일 사슬 항체 프레그먼트(scFv)의 재조합 발현을 기술하였다. Shusta는 이스트 시스템에서 숙주 염색제내로 트랜스유전자의 통합과 에피솜 발현 벡터의 사용간의 선택은 분비에 크게 영향을 줄 수 있다고 보고하였으며(Parekh 0026# Wittrup, 1997, Biotechnol, Prog., 13 , 117-122), δ 통합 벡터를 이용한 scFv 유전자의 숙주 염색체내로의 안정한 통합은 2㎛-기초 발현 플라스미드의 사용에 비해 우수하였다. Parekh 0026# Wittrup, op. cit.는 이미 우 췌장 트립신 저해제(BPTI)의 발현이 2㎛-기초 발현 플라스미드보다는 δ 통합 벡터를 이용하여 크기 순서로 증가 되었음을 가르친 바 있다. 2㎛-기초 발현 플라스미드는 이종성 분비 단백질의 생산에 반-생산적인 것으로 언급되었다. Bao et al, 2000, Yeast, 16 , 329-341은 KlPDI1 유전자가 다중-복제 플라스미드, pKan707상의 K. lactis내로 도입되었음을 보고하였으며, 상기 플라스미드의 존재는 상기 스트레인의 저조한 성장을 야기하였음을 보고하였다. Bao et al, 2000, Bao 0026# Fukuhara, 2001, Gene, 272, 103-110의 초기 발견에 비추어 숙주 염색체상의 KlPDI1의 단일 복제물을 도입하는 것이 선택되었다. 따라서, 상기 기술은 숙련자에게 다중복제 벡터보다는 이스트 염색체내로 트랜스유전자를 통합하는 것을 가르치고 있다. 따라서, 이스트를 형질변형하는 다른 방법이 요구된다.