유전자 발현 기술 document_id A220623042786

Hartl(1996, Nature, 381 , 571-580)는 샤프롱(chaperone)으로 알려진 단백질 종류는 다른 단백질의 불안정한 이형태체(conformer)에 결합하여 안정화시키고, 조절된 결합 및 해리를 통해서 생체내(in vivo)에서 이의 운명, 즉 폴딩(folding), 올리고머 형태로 어셈블리, 특정 세포내 소기관으로의 수송, 또는 분해에 의한 제거가 정확히 이루어지도록 돕는 단백질이라고 정의하고 있다. BiP(또한 GRP78, Ig 중쇄 결합 단백질(Ig heavy chain binding protein) 및 이스트에서 Kar2p로도 알려져 있음)는 hsp70 그룹에서 다량 존재하는 70kDa의 샤프롱으로서, 소포체에 존재하여 다른 기능들 중에서 분비 시스템에서 수송을 돕고 단백질을 폴딩하는 역할을 수행한다. 단백질 디설피드 이소머라아제(protein disulphide isomerase(PDI))는 소포체에 존재하는 샤프롱 단백질로서, 번역후 단백질 프로세싱시 디설피드 결합 형성을 촉매한다. 야생형과 외래 단백질의 분비에 대한 연구를 통해서 소포체로부터 골지체로의 수송이 속도결정단계임이 밝혀졌다. BiP는 정상적인 단백질과 일시적으로 결합하고 단백질의 돌연변이체 또는 잘못 폴딩된 형태와는 좀 더 안정하게 상호작용한다. 따라서, BiP는 폴딩 전구체를 가용화하고 미폴딩되고 어셈블링되지 않은 단백질의 수송을 방지하는 이중 역할을 수행한다. Robinson 및 Wittrup(1995, Biotechnol. Prog. 11 ,171- 177)는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 외래 단백질의 분비가 BiP(Kar2P) 및 PDI 단백질 농도에 미치는 영향을 조사하였고, 이때 웨스턴 분석을 통해서 외래 분비 단백질의 항시적 발현을 연장하는 경우 가용성 Bip 및 PDI의 농도가 검출불가능한 수준까지 감소함을 발견하였다. 이러한 이종 단백질 분비에 의해서 소포체에서 샤프롱 및 폴딩촉진효소(foldase)의 농도가 감소한 결과는 이스트 발현/분비 시스템을 개선하려는 노력이 필요함을 암시한다. 샤프롱의 발현은 미폴딩 단백질 반응(unfolded protein response (UPR))을 포함하는 다양한 기작에 의해서 조절된다. 재조합 기술을 이용하여 다수의 PDI 유전자 복제본(copy)을 생성하였을 경우 숙주세포에서 PDI 단백질 농도가 증가하였다 (Farquhar 등, 1991, Gene, 108 ,81-89). 국제특허공개 제 WO 93/25676호(1993년 12월 23일자로 공개됨)는 최초로 이종 단백질의 생성을 증가시키는 수단으로서 PDI를 암호화하는 유전자와 디설피드 결합된 이종 단백질의 공동발현을 제안하였다. 상기 특허공개 제 WO 93/25676호는 안티스타신(antistasin) 및 진드기로부터 추출한 항응고 단백질(tick anticoagulant protein)의 재조합적 발현은 PDI와의 공동발현을 통해서 증가될 수 있음을 기술하고 있다. 이러한 전략이 다른 종류의 단백질의 재조합적 발현을 증가시키기 위해 적용될 수 있는 지의 여부가 조사되고 있다. Robinson 등(1994, Bio/Technology, 12 , 381-384)의 보고에 따르면, 재조합 기술을 이용하여 사카로미세스 세레비지에에서 추가적인 PDI 유전자 복제본을 생성함으로써 PDGF(human platelet derived growth factor) B 동종이량체(homodimer) 및 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosacharomyces pombe) 산 포스파타제의 재조합적 발현을 각각 10배 및 4배 증가시킬 수 있다. Hayano 등(1995, FEBS Letters, 377 ,505-511)은 이스트에서 사람 리소자임과 PDI의 공동발현을 보고하였다. 기능을 가진 리소자임의 생성 및 분비는 30-60% 정도 증가하는 것으로 나타났다. Shusta 등(1998, Nature Biotechnology, 16 ,773-777)의 보고에 따르면, 숙주세포에서 PDI를 과발현시킬 경우 scFv(single-chain antibody fragment)의 재조합적 발현이 2배 내지 8배 증가하였다. Bao 및 Fukuhara(2001, Gene, 272 ,103-110)의 보고에 따르면, 이스트 PDI 유전자(KlPDI1)의 추가적인 재조합 복제본과의 공동발현을 통해서 이스트 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 재조합 사람혈청알부민(rHSA)의 발현 및 분비를 15배 증가시킬 수 있다. PDI 유전자와 이종 단백질 유전자로 동시에 형질전환된 이스트를 생성하기 위해서, 국제특허공개 제 WO 93/25676호는 상기 두 개의 유전자는 염색체 내로 통합(chromosomal integration)되거나; 두 개의 유전자 중 하나는 염색체 내로 통합되고 다른 하나는 플라스미드 상에 존재하거나; 각 유전자를 서로 다른 플라스미드에 도입하거나; 두 유전자를 동일한 플라스미드에 도입할 수 있다고 기술하고 있다. 상기 특허공개 제 WO 93/25676호는 다음과 같이 예시하고 있다: 염색체 내로 통합된 PDI 유전자 복제본을 추가로 가지고 있는 이스트 균주에서 pKH4α2 플라스미드로부터 안티스타신(antistasin)의 발현 (실시예 16 및 17); 추가의 PDI 유전자 복제본을 다중복제(multicopy) 이스트 셔틀벡터 YEp24(Botstein 등, 1979, Gene, 8 ,17-24)에 삽입하여 제조한 K991 벡터로부터 안티스타신의 발현 (실시예 20); 및 이스트 셔틀벡터 pC1/1(Rosenberg 등, 1984, Nature, 312 ,77-80)로부터 각각 GAL10 및 GAL1 프로모터 조절하에서 안티스타신 및 PDI 유전자의 발현. 사실, Robinson 및 Wittrup( 1995, op. cit.)는 또한 에리트로포에틴(erythropoietin)를 발현시키기 위해 GAL1-GAL10 유전자사이 영역(intergenic region)을 이용하였고, 이종 단백질을 분비시키기 위해서 이스트 균주는 엄격한 억제 및 유도가능한 프로모터를 이용하여 제조되어야한다고 결론지었다. 만약 그렇지 않으면, 대량생산용 발효기를 채우기 위해 많은 세대를 거쳐 세포를 성장시켰을 경우 이종 단백질의 지속적인 분비의 부정적 효과(즉, 검출가능한 BiP 및 PDI 농도의 감소)가 지배적으로 나타날 수 있다. 이후 계속된 연구를 통해서 트랜스유전자(transgene)의 염색체 내로의 통합이 재조합 단백질 생성을 최대화시키는 데 있어서 중요한 요소임이 밝혀졌다. Robinson 등(1994, op. cit.)은 추가적인 PDI 유전자 복제본을 염색체 내로 통합시킴으로써 PDGF 및 에스. 폼베 산 포스파타제(S. pombe acid phosphatase)의 발현을 증가시켰다. Robinson 등은 PDI 단백질 농도를 증가시키기 위해서 다중복제 2 μm 발현벡터를 이용하는 것은 이종 단백질 분비에 있어서 이롭지 않다고 보고하였다. Hayano 등(1995, op. cit.)은 사람 리소자임 및 PDI 유전자를 각각 선형 통합벡터로 삽입하고 이스트 숙주에 도입하여 염색체내 통합을 유도하였다. Shusta 등(1998, op. cit.)의 보고에 따르면, 이스트 시스템에서 단백질 분비는 트랜스유전자를 숙주 염색체 내로 통합 또는 에피솜 발현벡터를 사용하느냐에 따라서 크게 영향을 받을 수 있으며, 문헌: Parekh 0026# Wittrup, 1997, Biotechnol. Prog., 13 , 117-122을 참고하면서 δ 통합벡터를 이용하여 scFv 유전자를 숙주 염색체 내로 통합하는 것은 2 μm-기초 발현 플라스미드를 이용하는 것보다 우수한 효과를 제공한다. Parekh 및 Wittrup(op. cit.)는 이전의 연구에서 2 μm-기초 발현 플라스미드보다는 δ 통합벡터를 이용할 때 BPTI(bovine pancreatic trypsin inhibitor)의 발현이 증가하였다고 보고하였다. 2 μm-기초 발현 플라스미드는 이종 분비 단백질의 생성을 방해하는 것으로 설명되고 있다. Bao 및 Fukuhara 등(2001, op. cit.)은 "최초로 KlPDI1 유전자를 rHSA 발현카세트를 함유하는 다중복제(multi-copy) 벡터에 도입하였다. 그러나, 이러한 구조체는 이스트 성장 및 플라스미드의 안정성에 악영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다. 이것은 본 발명자들이 이전에 발견한 다중복제 벡터 상에 존재하는 KlPDI1 유전자는 케이. 락티스(K. lactis) 세포의 성장에 해롭다는 사실을 뒷받침한다(Bao 등, 2000)"고 보고하였다. 상기 Bao 및 Fukuhara의 인용 내용에서 언급한 바와 같이, Bao 등(2000, Yeast, 16 , 329-341)은 KlPDI1 유전자를 다중복제 플라스미드 상에 존재하는 상태로(pKan707) 케이. 락티스에 도입하였을 경우 이러한 플라스미드의 존재는 케이. 락티스의 성장을 저하시킨다고 보고하였다. Bao 등은 KlPDI1 유전자의 과발현은 케이. 락티스에 해롭다고 결론지었다. Bao 등에 의한 이러한 초기 발견에 기초하여 Bao 및 Fukuhara는 숙주 염색체 상에 하나의 KlPDI1 유전자 복제본을 도입하기로 결정하였다. 이러한 배경과는 반대로, 본 발명자들은 놀랍게도 종래 기술의 제안과는 상반된 것으로서 이스트에서 샤프롱 단백질 유전자와 이종 단백질 유전자를 2 μm-패밀리(2 μm-family) 다중복제 플라스미드 상에서 공동발현시켰을 경우 이종 단백질의 생성이 실질적으로 증가하는 것을 발견하였다.