란타나이드 킬레이트 및 생물 분석에서의 그의 용도 document_id A220623044175

형광 분광법에서 란타나이드 착물을 사용하는 점은 이미 공지되었다. US 4,374,120으로부터는 50 내지 1000 마이크로초의 상대적으로 긴 형광 시간을 갖는 형광 마커로서 Eu-킬레이트와 Tb-킬레이트가 소개되었으며, 이와 관련한 리간드는 특히 아미노폴리카르본산이다. 또한, 몇몇 란타나이드-형광-킬레이트 착물이 시간 분해 형광 측정법에 대해 특히 적합하다는 점도 공지되었다. 이와 관련하여 Tb(Ⅲ)-BPTA-NHS 및 Eu(Ⅲ)-에스트로겐이 바람직하며, Tb(Ⅲ)-BPTA-NHS는 DNA 혼성화 분석에서 이용된다 (문헌 [Matsumoto, K. et al., RIKEN Review 35, May, 2001] 참조). 란타나이드 킬레이트는 WO 00/01663에 따라 HTRF (균일한 시간 분해 형광)-분석에서 이용된다. 공지된 점에 따르면 시아닌 염료 및 인도시아닌 염료는 생물 임상 의학에서 이용된다 (US 6,217,848, 추가의 검증 자료를 구비한 US 6,190,641). DE 42 22 255는 유전자 탐침 진단법에서의 이용을 위해 란타나이드 이온 킬레이트화 구조를 갖는 표지 시약을 기술하고 있다. 란타나이드 이온 킬레이트화 구조로서는 피리딘 유도체가 선호되며, 스페이서로서는 폴리알킬아민, 폴리에틸렌글리콜이 선호되며, 감광성 성분으로는 푸로쿠마린 유도체가 선호된다. 타칼로, 에이치 (Takalo, H.) 등의 문헌 [Journal of Alloys and Compounds 1995, 225, 511-14]의 112쪽에는 Tb(Ⅲ) 및 Eu(Ⅲ) 킬레이트와 이 킬레이트의 발광 수율에 대해 기술되어 있다. 인산화 활성을 측정하기 위해 DE 698 13 850에 따라서는 크립테이트가 이용된다. 이 크립테이트는 Tb, Eu, Sm, Dy, Nd와 같은 희토류 분자와 비스피리딘과 같은 착물 형성제를 함유한다. 또한, 상기 크립테이트는 형광성 공여체 화합물로서 이용된다. 헤밀라, 아이 (Hemmilaa, I) 및 웹, 에스 (Webb, S.)는 문헌 [DDT, 1997, 2, 373-381]에서 약물 선별을 위해 란타나이드 킬레이트를 이용한 시간 분해 형광 측정법 (TRF)의 원리를 기술하였다. DE 102 59 677에서는 핵산을 검출하기 위한 프로브가 소개되었다. 이러한 프로브는 바람직한 실시예에 따라 형광단으로서 희토류 염료를 이용한다. 공여체로부터 수용체 상으로 이루어지는 에너지 전이를 측정함으로써 생물 분석 시에 이용하기 위해, 상기한 에너지 전이를 실행할 수 있는 화합물을 사용하여야 한다. 이를 위해, 공간상 상호 간에 분리된 2개의 쌍극자의 상호 작용을 바탕으로 하는 에너지 전이의 특별한 형태로서 형광 공명 에너지 전이 (FRET)가 적용될 수 있다. 이와 관련하여 상기 쌍극자들에 의해 (공여체)가 전자 여기된다. 만일 두 쌍극자가 상호 간에 공명 상태에 존재한다면, 형광성 공여체의 여기 에너지는 방사선 없이 수용체 상으로 전이될 수 있다. FRET는, 높은 민감성과, 공여체와 수용체 사이의 이격 거리에 대한 강력한 종속성을 바탕으로, 생물학적으로 관련된 기질을 식별하고 특성화하는데 다방면으로 적용되었다. 실질적인 개발은 균일한 형광 분석 [서열 및 접힘 마킹 (단백질), DNS]에서 FRET 시스템을 적용하는 것에 있다. 이와 관련하여, 반응에 참여하게 된 항원 및 항체는 형광단 그룹으로 표시되며, 이러한 그룹의 경우 하나의 형광단은 에너지 공여체로서, 다른 형광단은 대응하는 에너지 수용체로서 기능한다. 임상 실험 진단학뿐 아니라 조합 약품 제조학에서 분자 대 분자의 상호 작용을 직접적으로 검증하기 위한 FRET-원리의 포괄적 적용은 상기한 공여체 및 수용체의 이용 가능성을 전제로 하며, 공여체 및 수용체는 장파의 스펙트럼 영역에서 효율적인 분광학상 흡수 및 방출 거동을 특징으로 한다. 이와 관련하여, 생물학적 기질의 여기를 회피하기 위해, 공여체의 여기 파장은 350 nm 초과가 되어야 한다. 이때 생물학적 시험 방법에서 상기한 공여체 및 수용체를 적용하기 위한 추가의 본질적인 기준은, 표지된 분자의 안정성 및 그 생물학적 활성이 저하되지 않으면서, 생물고분자-형광단의 안정적인 공유 결합이 형성되는 것에 있다. 이러한 영역에 대한 인식의 관점에서, 정밀성 및 단기간 데이터 이용 가능성에 대한 요건에 상응하는 적합한 공여체-수용체 시스템이 요청된다. 왜냐하면 공지된 공여체-수용체 시스템은 몇 가지 단점이 있기 때문이다. 따라서, 공여체로부터 수용체 상으로 이루어지는 에너지 전이가 종종 만족스럽지 못하다. 특히 분석 방법의 민감도가 전체적으로 만족스럽지 못하다. 또한, 공여체의 착물 안전성은 종종 충분하지 못하며, 그리고 공여체의 수용성 역시 불충분하다. 전술한 단점들의 원인은 우선적으로 구조, 다시 말해 공여체 화합물의 구조에 있다. 지금까지 흡수 및 방출의 요구되는 분광 특성을 갖는 공여체 화합물들 중에서 높은 안정성의 화합물을 제공하지 못하고 있다. 또한, 지금까지 이용되던 수용체 염료는 선택의 화합물이 아니다. 왜냐하면 이용되어 오던 수용체 염료의 경우 공여체의 방출 스펙트럼과 관련하여 수용체 염료 자신의 흡수 최대값이 조정되지 못했으며, 그리고 지금까지 수용체 염료의 충분한 용해도를 보장할 수 없었기 때문이다. 형광단을 목적에 따라 적용하기 위해, 새로운 화합물의 합성시 일차적으로는, 공여체로부터 대응하는 수용체로 이루어지는 에너지 전이의 효율 증대와 그에 따른 분석 방법의 민감도의 증대가 개발되어야 한다. 이러한 요구는 에너지 공여체로서 란타나이드 착물을 이용함으로써 고려될 수 있었다. 이때 폴리아미노 폴리카르본산은 적용에 관련한 특별한 발색단 잔기를 이용하여 란타나이드(Ⅲ) 이온을 킬레이트화한다. 폴리아미노 폴리카르본산을 통해 실질적인 형광단, 즉 란타나이드(Ⅲ) 이온을 착물화함에 따라, 이용되는 공여체의 높은 착물 안정성과 수성 매질에서의 우수한 용해성이 보장되었다. 이와 같이 최초로 이용되는 란타나이드(Ⅲ) 착물의 특징은, 사전 지정된 파장 영역에서 흡수하고 그에 따라 여기 파장에 맞게 조정될 수 있는 치환체 (이하, 안테나로 지칭됨)를 통해 리간드 시스템을 개질하는 것에 있다. 형광 분석 시 에너지 공여체로서 란타나이드(Ⅲ)-화합물의 이용은, 유기 공여체와 비교하여, 민감성 및 신호 대 잡음 비와 관련하여 분광학상 장점을 제공하였으며, 그에 따라 특히 조합 약품 제조학에서도 다양한 새로운 적용 양태가 제공되었다. 이에 대한 근거는, 큰 스토크스 이동 (Stokes shift), 즉 여기된 상태의 높은 세기 및 긴 수명과 결부되는 선 모양의 방출과 같이, 란타나이드(Ⅲ) 착물을 특징짓는 분광 특성이다. 또한, 란타나이드(Ⅲ) 화합물의 주요 장점은 시간 분해식 스펙트럼 기록과 더불어 공여체와 수용체가 바람직한 이격 거리를 갖는다는 점에 있다. 이와 관련하여 공여체와 수용체 간의 바람직한 이격 거리는 불완전하게 표지된 기질에 대해 더욱 양호한 신호 분리 및 신호 증대를 가능케 하고, 일반적으로 큰 표지를 허용한다.