마이크로제조된 통합된 ＤＮＡ 분석시스템 document_id A220623044236

생물체의 게놈은 DNA(디옥시리보핵산), 또는 일부 바이러스의 경우에 RNA(리보핵산)에 의해 정의된다. 게놈 염기서열분석은 DNA 또는 RNA 가닥의 뉴클레오티드 또는 염기의 순서를 파악한다. DNA의 게놈-규모 염기서열분석(genome-scale sequencing)을 위한 현재의 접근법은 도 1에 도시한다. 이런 Shotgun 염기서열분석(Shotgun sequencing) 접근법(100)은 개별 게놈 DNA 단편을 조작하기 위하여, 박테리아 형질전환(bacterial transformation), 선별(selection), 성장을 이용한다. 이런 접근법의 초기 3 단계, 전단(shearing), 벡터 결찰(vector ligation), 형질전환(transformation)(단계 102, 104, 106)은 1회 수행만을 요한다. 따라서, 이들은 별다른 문제점을 유발하지 않는다. 마지막 단계, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)(CE)(단계 114)은 마이크로제조(microfabrication)를 통하여 소형화되고 있다. 이는 상기 단계와 연관된 비용과 처리 시간을 감소시켰다. 하지만, 도말과 성장(단계 108) 및 채집, 성장, 추출 단계(단계 110)는 문제가 있다. Sanger 신장 단계(단계 112)를 선행하는 이들 단계는 클론 분리(clone isolation)와 삽입체 증폭(insert amplification)을 수행한다. 증폭은 박테리아, PCR(중합효소 연쇄 반응) 또는 RCA(롤링 서클 증폭, rolling circle amplification)일 수 있다. 이들 단계는 소형화(miniaturization)와 통합(integration)이 여전히 어렵다. 따라서, 현재의 현미경적 전범(macroscopic paradigm)은 이들 핵심 단계를 위한 가능 기술로서 로봇공학(robotics)에 의존해왔다. 하지만, 게놈에 대한 염기서열분석 주형을 산출하기 위하여 대략 3천만 개의 콜로니를 선택하고 성장시켜야 하기 때문에, 이는 해결해야 할 과제이다. 더 나아가, 이런 로봇공학 기술로 제조된 물질의 최소량은 현대의 마이크로제조된 CE 분석 시스템에 의해 요구되는 것보다 높은 크기 자리수(order of magnitude)이다. 이런 이유로, 게놈 염기서열분석의 처리 시간(processing time), 크기 규모(volume scale), 통합 수준을 개선하는 것이 요구된다. 또한, 게놈 염기서열분석의 비용과 공간 요건을 감소시키는 것이 요구된다. 요약 한 측면에서, 본 발명은 클론 염기서열분석 주형(clonal sequencing template)의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소(microreactor element)를 복수의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)에 분산시키는 분산 채널(distribution channel)을 보유하는 마이크로제조된 구조물에 관계한다. 단지 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버를 통과하고, 여기서 열 사이클링 신장 단편(thermal cycling extension fragment)이 마이크로반응기 요소로부터 생산된다. 이들 신장 단편을 포획하고 농축하기 위하여, 열 사이클링 챔버에 정제 챔버(purification chamber)가 연결된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여, 정제 챔버에 성분 분리 채널(component separation channel)이 연결된다. 본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소(microcarrier element)가 포함된다. 상기 마이크로반응기 요소는 거환(bolus) 또는 마이크로에멀젼 액적(microemulsion droplet)이다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어(microsphere)가 포함된다. 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형이다. 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 관계한다. 상기 시스템은 DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하기 위한 수단 및 이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물(circular product)과 오염 선형 산물(linear product)의 혼합물을 형성하기 위한 수단을 보유한다. 상기 시스템은 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 수단 및 단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 생산하기 위한 수단을 추가로 보유한다. 상기 시스템은 또한, 어떤 마이크로반응기 요소가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 수단 및 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로반응기 요소를 열 사이클링 챔버로 분산시키기 위한 미세유체 분산 수단(microfluidic distribution means)을 보유한다. 부가적으로, 상기 시스템은 단지 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 수단 및 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단(extension means)을 보유한다. 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 정제 챔버 수단(purification chamber means) 및 신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단(component separation means) 역시 상기 시스템의 일부분이다. 본 발명의 다른 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함된다. 상기 마이크로반응기 요소는 거환 또는 마이크로에멀젼 액적이다. 마이크로반응기 요소에는 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함된다. 다른 측면에서, 본 발명은 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어를 복수의 열 사이클링 챔버에 분산시키는 분산 채널(distribution channel)을 보유하는 마이크로제조된 구조물에 관계한다. 단지 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트(exit port)에 자동밸브(autovalve)가 배치되고, 여기서 열 사이클링 신장 단편이 마이크로스피어로부터 생산된다. 이들 신장 단편을 포획하고 농축하기 위하여 열 사이클링 챔버에 정제 챔버가 연결된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 정제 챔버에 성분 분리 채널이 연결된다. 본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로스피어의 직경은 대략 1 내지 100 마이크론이다. 마이크로스피어의 직경은 대략 10 마이크론이다. 각 열 사이클링 챔버는 분리 채널과 유체 소통(fluid communication)한다. 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형이다. 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단을 보유하는 마이크로제조된 구조물에 관계한다. 단지 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버(thermal cycling chamber)로 유동하도록 담보하기 위한 자동밸브 수단이 이용된다. 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단은 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산한다. 이들 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위하여, 통합된 정제 챔버 수단이 이용된다. 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 성분 분리 수단이 이용된다. 본 발명의 다른 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 신장 수단은 복수의 열 사이클링 챔버를 보유하는 Sanger 신장 수단이다. 자동밸브 수단에는 열 사이클링 챔버의 출구 포트(exit port)에서 자동밸브가 포함된다. 정제 챔버 수단에는 열 사이클링 챔버에 연결된 정제 챔버가 포함된다. 성분 분리 수단은 정제 챔버에 연결된 복수의 마이크로채널을 보유하는 모세관 집적형 전기영동 수단(capillary array electrophoresis means)이다. 염기서열분석 주형은 DNA 또는 RNA 염기서열분석 주형이다. 다른 측면에서, 본 발명은 열 사이클링 챔버를 포함하는 마이크로제조된 기구(microfabricated apparatus)에 관계한다. 상기 열 사이클링 챔버는 클론 주형(clonal template)을 내포하는 마이크로스피어를 수용하도록 배치된다. 상기 챔버는 입구 포트(inlet port)와 출구 포트(outlet port)를 보유하고, 상기 출구 포트는 챔버에서 마이크로스피어를 트랩(trap)하고 열 사이클링 챔버로의 추가적인 유동을 실질적으로 차단하도록 배치된 조임 장치(constriction)를 보유한다. 본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 조임 장치의 모양은 실질적으로 원형 또는 반원형이다. 첫 번째 밸브는 입구 포트와 유체 소통하는 입구 채널(inlet channel)에 배치되고, 두 번째 밸브는 출구 포트와 유체 소통하는 출구 채널(outlet channel)에 배치된다. 작동 중에, 두 번째 밸브는 열 사이클링에 앞서, 마이크로스피어를 조임 장치 외부와 열 사이클링 챔버의 주요 본체 부분으로 순차적으로 이동시키기 위하여 첫 번째 밸브에 앞서 닫힌다. 정제 챔버는 열 사이클링 챔버의 출구 포트와 유체 소통하고, 정제 챔버의 출구 포트는 성분 분리 기구(component separation apparatus)와 유체 소통한다. 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 관계한다. 상기 시스템은 DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하기 위한 수단 및 이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단을 보유한다. 상기 시스템은 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 수단 및 단일 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하기 위한 수단을 추가로 보유한다. 상기 시스템은 또한, 어떤 마이크로스피어가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 수단 및 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위한 미세유체 분산 채널 수단을 보유한다. 부가적으로, 상기 시스템은 통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위한 수단을 보유한다. 상기 시스템은 또한, 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위한, 열 사이클링 챔버를 비롯한 신장 수단을 보유한다. 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위한 정제 챔버 수단 및 신장 단편을 분석하기 위한 성분 분리 수단 역시 상기 시스템의 일부분이다. 본 발명의 다른 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 담보 수단(ensuring means)은 열 사이클링 챔버에서 자동밸브(autivalve), 광 검출기(optical detector), 시간 장치(timing mechanism) 중에서 적어도 하나이다. 광 검출기는 마이크로스피어로부터 산란된 광을 검출하는 광 스캐너(optical scanner)이다. 시간 장치에는 열 사이클링 챔버의 입구에 인접하여 배치된 공기 입력기(pneumatic input)가 포함된다. 다른 측면에서, 본 발명은 DNA 염기서열분석을 수행하기 위한 시스템에 관계한다. 상기 시스템은 DNA를 DNA 단편으로 전단하기 위한 수단 및 DNA 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하기 위한 수단을 수반한다. 상기 시스템은 또한, 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하기 위한 엑소뉴클레아제 분해 수단 및 단일 DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어를 산출하기 위한 에멀젼 PCR 반응 수단을 보유한다. 부가적으로, 상기 시스템은 어떤 마이크로스피어가 DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하기 위한 형광 활성화 세포 분류(fluorescent activated cell sorting, FACS) 수단을 보유한다. DNA 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로스피어를 열 사이클링 챔버에 분산시키기 위하여 미세유체 분산 채널 수단이 이용된다. 통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 자동밸브 수단이 이용된다. DNA 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편을 생산하기 위하여 열 사이클링 챔버를 비롯한 Sanger 신장 수단이 이용된다. 이들 신장 단편을 포획하고 정제하며 농축하기 위하여 통합된 정제 챔버 수단이 이용되고, 이들 신장 단편을 분석하기 위하여 모세관 집적형 전기영동 수단이 이용된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석을 수행하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 DNA 또는 RNA를 단편으로 전단하고; 이들 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하고; 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하는 단계를 포함한다. 상기 방법에는 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소를 산출하고; 어떤 마이크로반응기 요소가 염기서열분석 주형을 보유하는 지를 선택하고; 염기서열분석 주형을 보유하는 선택된 마이크로반응기 요소를 열 사이클링 챔버에 분산시키는 단계를 포함한다. 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로반응기 요소로부터 열 사이클링 신장 단편이 생산된다. 이들 신장 단편을 포획되고 농축되며 분석된다. 본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로캐리어 요소가 포함된다. 상기 마이크로반응기 요소는 거환 또는 마이크로에멀젼 액적이다. 마이크로반응기 요소에는 클론 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어가 포함된다. 분산 단계(distributing step)는 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버를 통과하도록 수행된다. 하나의 마이크로반응기 요소가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브가 이용된다. 산출 단계(generating step)는 에멀젼 PCR 반응 또는 유통(flow through) PCR 과정으로 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 생산하는 과정을 포함한다. 선택 단계(selecting step)는 형광 활성 세포 분류(FACS)이다. 다른 측면에서, 본 발명은 DNA 염기서열분석을 수행하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 DNA를 DNA 단편으로 전단하고; DNA 단편을 결찰시켜 원하는 원형 산물과 오염 선형 산물의 혼합물을 형성하고; 엑소뉴클레아제 분해로 오염 선형 산물을 선택적으로 제거하는 단계를 포함한다. 에멀젼 PCR 반응으로, DNA 염기서열분석 주형의 복수 클론 사본을 내포하는 마이크로스피어가 산출된다. 형광 활성 세포 분류(FACS)로, DNA 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어가 검출된다. DNA 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어는 열 사이클링 챔버로 분산된다. 통계학적으로, 하나의 마이크로스피어가 하나의 열 사이클링 챔버로 유동하도록 담보하기 위하여 열 사이클링 챔버의 출구 포트에서 자동밸브가 이용된다. DNA 염기서열분석 주형의 복수 사본을 내포하는 마이크로스피어로부터 열 사이클링 신장 단편이 생산된다. 신장 단편은 포획되고 정제되며 농축되고 분석된다. 본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 포획 단계(capturing step)는 올리고뉴클레오티드 포획 매트릭스(oligonucleotide capture matrix)를 이용한다. 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석에 이용되는 방법에 관계한다. 상기 방법은 열 사이클링 챔버의 입구 포트에서, 클론 주형을 내포하는 마이크로스피어를 수용하고; 상기 챔버의 출구 포트에서 조임 장치를 이용하여 챔버 내에서 마이크로스피어를 트랩하고 챔버로의 추가적인 유동을 실질적으로 차단하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 염기서열분석 주형을 내포하는 마이크로스피어를 산출하는 단계를 포함하는 분석 방법에 관계한다. 상기 마이크로스피어는 열 사이클링 챔버로의 추가 유동이 실질적으로 차단되도록 상기 챔버 내에 출구 포트에서 조임 장치의 이용으로, 상기 챔버에 배치된다. 본 발명의 다양한 실시는 아래의 특징 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. 첫 번째 밸브는 열 사이클링 챔버의 입구 포트에 배치되고, 두 번째 밸브는 열 사이클링 챔버의 출구 포트에 배치되고, 상기 두 번째 밸브는 첫 번째 밸브에 앞서 닫힌다. 이로 인하여, 마이크로스피어는 열 사이클링에 앞서, 조임 장치 외부와 열 사이클링 챔버의 주요 본체 부분으로 순차적으로 이동된다. 본 발명은 아래의 이점 중에서 한가지이상을 보유할 수 있다. Shotgun 게놈 염기서열분석에 요구되는 수고스런 박테리아 조작이 편의하게 자동화되고 통합된 시험관내 단계로 대체된다. 이로 인하여, 무수한 수동이나 로봇 콜로니 선별 작업이 생략된다. 염기서열분석 신장 단편을 생산, 정제, 분리하는데 필요한 모든 유체와 온도 조절 구조가 마이크로제조된 장치에 통합된다. 상당한 비용, 시간, 공간이 절약될 수 있다. 다른 유전자 분석 기술이 수행될 수 있다. 본 발명의 이들 특징과 이점은 아래의 상세한 설명 및 동반된 도면에서 더욱 상세하게 기술되는데, 이들은 본 발명의 원리를 예시할 뿐 본 발명을 한정하지 않는다.