이핵성 효소의 강력한 저해제로서의 디아릴알칸 document_id A220623044450

과도한 피부 착색을 저해하거나 예방할 수 있는 물질에 대한 요구가 높다. 피부의 선천적 색소 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocytes) 안에 존재하는 막 결합 세포기관인 멜라노솜(melanosomes)에서 합성된 질소 중합체(nitrogenous polymer)이다. 다양한 농도로 생성된 멜라닌은 피부 타입(유전적 성질) 및 환경 요인에 의존한다. 멜라노사이트는 표피(epidermis)의 기저막에 존재하는 세포이며 세포 구성물의 5% 및 10% 사이를 차지한다(대략 cm2 당 1200-1500 멜라노사이트). 멜라노사이트는 자외선(ultraviolet light; UV)과 같은 인자에 의해 자극될 때 더욱 빠르게 분열하여 더 많은 양의 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 그 후 케라티노사이트(keratinocytes)에서 성숙한 멜라노솜으로 이동되어 표피 안에서 갈색의 피부색을 나타낸다. 인간의 피부에서 멜라노사이트의 수는 피부색과 상관없이 대체로 동일하다. 피부색은 생성된 멜라닌(흑색의 유멜라닌(eumelanin) 또는 황색을 띄는 연갈색의 페오멜라닌(pheomelanin))의 양과 타입에 크게 의존한다. 아시아인 및 옅은 색의 피부를 가진 사람들은 어두운 색의 피부를 가진 사람들보다 유멜라닌의 농도가 낮으며 방사선의 영향에 대해 상대적으로 덜 보호된다. 빨간 머리색을 가진 사람은 페오멜라닌 색소로 특징지워지며 광보호가 거의 없거나 없다. 게다가, 피부에서 멜라닌의 분포 또한 다양하다. 밝은색의 피부를 가진 사람들에서 대부분의 색소가 기저층에 위치하는 반면, 어두운색의 피부를 가진 사람들에서 멜라닌은 각질층(horny layer)에 도달하는 모든 부분에 퍼져있다. 멜라닌의 과생성은 상이한 형태의 병적인 피부색, 모색(hair color) 및 피부의 또 다른 질병 및 질환을 야기할 수 있다. 피부 색소침착과 관련된 두개의 질환이 있다. 피부의 흑화(darkening)는 UV 노출 및 노화에 의해 야기된 병적으로 높아진 멜라닌; 및 피부 색소의 이상 분포에 의한 노화반점(age spots), 기미(liver spots) 및 의약품 및 상처/질병 유도 색소과다침착(hyperpigmentation)을 포함한다(Seiberg et al., (2000) J. Invest. dermatol. 115:162; Paine et al. (2001) J. Invest. Dermatol. 116:587). 멜라닌 세포 생성(melanogenesis)의 조절제(modulator)는 도1에 나타낸 다양한 방식의 기능을 가지도록 선택되거나 설계될 수 있다. 도1을 참고하여, 이들은 멜라닌 생성에 앞서 멜라노솜의 구조 및 기능을 직접적으로 조절할 수 있고, 멜라닌의 합성에 관계된 티로시나아제(tyrosinase)와 같은 효소의 생성 또는 기능을 저해할 수 있고, 유멜라닌/페오멜라닌의 비율을 변화시킬 수 있거나 케라티노사이트에서 멜라노사이트로부터 멜라노솜의 이동을 담당하는 댐핑 메카니즘(damping mechanisms)에 의해 기능할 수 있다(Briganti et al. (2003) Pigment Cell Research 16:101-110). 티로시나아제는 멜라닌 생성에 있어서 주요 효소이다. 이 효소는 세개의 반응을 촉매한다: 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine)을 위한 티로신의 수산화반응(hydroxylation), DOPA 퀴논(DOPA quinone)을 위한 DOPA의 산화 및 인돌 퀴논(indole quinone)을 위한 DHI(5,6-dihydroxyindole)의 산화(Hearing et al. (1991) FASEB 53:515). 티로시나아제가 촉매 활성을 위해 기질 및 2가의 금속 이온 모두를 필요로 한다는 것이 측정되어졌다. 피부 미백을 목적으로 멜라닌 합성을 저해하기 위해 일반적으로 사용된 방법은 주로 티로시나아제 그 자체에 직접적으로 결합하거나 간접적으로 예를 들어, 필수 금속 이온과 복합체를 형성하는 티로시나아제 활성을 저해하는 물질에 기초하고 있다. 티로시나아제는 활성 부위에 2개의 구리 이온을 포함하는 타입 3 구리 단백질 패밀리에 속한다. 티로시나아제 활성 부위 구조에 대한 연구는 2개의 구리 이온이 가까이 위치하고 있으며 각각의 이온이 도2에 나타낸 것과 같이 N-ε 질소 원자의 측쇄를 통해 3개의 히스티딘과 연결되어 있음을 밝혔다(Pfiffner and Lerch (1981) Biochem. 20: 6029; Cuff et al. (1998) J. Mol. 278:855). 이핵성 구리 이온은 세가지 주요 레독스 형태(redox form)로 존재할 수 있다 : CuⅠ-CuⅠ 환원형, 과산화물로서 역으로 O2와 결합하는 CuⅡ-O2-CuⅡ형, 및 효소의 휴지형(resting form), 여기에서 Cu2+ 이온은 일반적으로 작은 리간드에 연결된다. CuⅡ-O2-CuⅡ 레독스 상태는 티로시나아제 효소 활성에 중요하다는 것이 측정되어졌다. 이 상태에서, 티로시나아제는 멜라닌 생합성에 중요한 반응인 모노-페놀(티로신과 같은)의 오르토 위치(ortho position)에 두번째 수산기의 도입을 촉매한다. 티로시나아제 활성 부위에서 모노페놀의 접근, 리간드 형성 또는 산화를 방해하는 어떤 화합물은 티로시나아제의 효과적인 저해제일 수 있으며, 잠재적으로 멜라닌 생성의 감소 및 더 밝은 피부색을 야기한다. 일반적으로 말하자면, 티로시나아제 활성 부위에서 구리 이온은 산소, 질소, 황 및 할로겐 표면의 고립전자쌍(lone pair electrons)과 쉽게 킬레이트 화합물을 형성할 수 있다(Weder et al. (1999) Inorg. Chem. 38:1736). 도3은 몇가지 알려진 티로시나아제 저해제의 활성 구조 및 메카니즘을 나타낸다(Briganti et al. (2003) Pigment Cell Research 16:101-110; Seo et al. (2003) J. Agric. Food Chem. 51:2837). 도3을 참고하면, 하이드로퀴논과 같은 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA)과 유사한 구조를 가지는 화합물은 티로시나아제를 저해하며 또한 멜라노사이트 용해 물질일 수 있다(U.S. Pat. No. 5,523,077). 예를 들어, 일반적인 월귤나무 우바우르(Uvae ursi)의 잎으로부터 분리된 알부틴은 인간의 멜라노사이트에서 멜라닌 합성에 영향을 주고 티로시나아제를 저해하는 천연으로 존재하는 하이드로퀴논의 베타-글루코피라노시드(beta-glucopyranoside)이다(Chakraborty et al. (1998) Pigment Cell Res. 11:206; U.S. Pat. No. 5,980,904). 알부틴 작용의 메카니즘은 티로시나아제 활성 부위에 결합하기 위한 L-티로신 또는 L-도파의 경쟁을 포함한다. 이것은 단백질의 발현 또는 합성을 억제할 수 없다(Maeda and Fukuda (1996) J. Pharmacol. Exp. 276:765). 합성 알부틴 타입 화합물은 또한 인간의 티로시나아제를 강력하게 저해한다(Sugimoto et al. (2003) Chem. Pharm. Bull. 51:798). 배양된 홍화(safflower; Carthamus tinctorius L.) 세포로부터 분리된 신규한 디퀴논(diquinone)인 키노비온 A(Kinobeon A)은 코직산(kojic acid) 보다 더 뛰어난 티로시나아제 저해 활성을 가진다(Kanehira et al. (2003) Planta Med. 69:457). 만일 오랜 기간동안 적용되거나 높은 농도의 하이드로퀴논에서는 심각한 부작용을 가질 수 있다. 게다가, 하이드로퀴논은 영구적인 탈색소(de-pigmentation)를 초래할 수 있으며 따라서 자외선에 노출되었을 때 피부의 감광성(photosensitivity)을 증가시킬 수 있다. 현재 사용되고 있는 내약성이 좋은(better-tolerated) 미백 물질은 천연물(natural origin)이다. 예를 들어, 코직산은 어떤 박테리아를 포함하는 탄수화물 용액으로부터 유래된 천연의 하이드록실-γ-피론(hydroxyl-γ-pyrone)이다. 도3을 참고하면, 코직산은 산화된 오르토-디하이드록시페놀로 볼 수 있다. 코직산은 금속 이온 특히 CuⅡ와 강력한 킬레이트 화합물을 형성한다고 알려져 있다(Gerard and Hugel (1975) Bull. Soc. Chim. Fr. 42:2404). 그것은 강력하게 길항적이지만 티로시나아제의 저해제에 결합하는 것이 느리다(Cabanes et al. (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46:982). 최근의 연구는 코직산이 염화 제이구리(dicopper (Ⅱ)) 복합체 및 염화 제이구리-이산소 부가물(dicopper-dioxygen adduct) 모두와 강력하게 결합하는 가교 리간드(bridging ligand)로서 작용하며, 따라서 효소에 카테콜(catechol) 기질의 결합을 예방함을 보여준다(Battaini et al. (2000) JBIC 5:262). 코직산 및 그의 에스테르는 피부 표백제의 용도로 특허출원되었다(U.S. Pat. Nos. 4,369,174; 4,771,060; 5,824,327; 5,427,775; 4,990,330을 참고하시오). 플라보노이드는 티로시나아제의 저해제로서 보고되어 있는 또 다른 종류의 천연물이다(Shimizu et al. (2000) Planta Med. 66:11; Xie et al. (2003) Biochem. 68:487). 활성 티로시나아제 저해제는 플라본(Likhitwitayawuid et al. (2000) Planta Med. 66:275), 플라보놀(Kubo and Kinst-Hori (1999) J. Agric. Food Chem. 47:4121), 프레닐화된(prenylated) 플라보노이드(Kuniyoshi et al. (2002) Planta Med. 68:79; Son et al. (2003) Planta Med. 69:559; Kim et al. (2003) Biol. Pharm. Bull. 26:1348), 플라반(No et al. (1999) Life Sci. 65:PL241; Kim et al. (2004) Biomacromolecules 5:474), 및 디하이드로칼콘(dihydrochalcones)(Shoji et al. (1997) Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:1963)을 포함한다. 티로시나아제 저해제의 다른 타입은 페놀 유도체(Sakuma et al. (1999) Arch. Pharm. Res. 22:335; Kerry and Rice-Evans (1999) J. Neurochem. 73:247; Battaini et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:44606), 벤즈알데히드(Kubo and Kinst-Hori (1999) Plant Medica 65:19; Chen et al. (2003) J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18:491; Nihei et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. 14:681), 벤조산 유도체(Curto et al. (1999) Biochem Pharmacol. 57:663; Chen et al. (2003) J. Protein Chem. 22:607; Miyazawa et al. (2003) J. Agric. Food Chem. 51:9653; Kubo et al. (2003) Z. Naturforsch [C] 58:713), 쿠페론(cupferron)(Xie et al. (2003) Int. J. Biochem. Cell Biol. 35:1658), 감초(Glycyrrhiza uralensis) 뿌리로부터의 벤조디피란(benzodipyran)(Yokota et al. (1998) Pigment Cell Res. 11:335), 티오하이드록실 화합물(Park et al. (2003) J. Protein Chem. 22:613), 테르펜(terpenoids)(Oh et al. (2002) Planta Med. 68:832) 및 옥사졸로디네티온(oxazolodinethione)(Seo et al. (1999) Planta Med. 65:683)을 포함한다. 가장 강력하다고 알려진 천연의 티로시나아제 저해제는 스틸벤(stilbenes)(IC50=0.3-5μM)(Shin et al. (1998) Biochem Biophys. Res. Commun. 243:801; Ohguchi et al. (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:1587), 스틸벤 글리코시드(Iida et al. (1995) Planta Med. 61:425) 및 4-치환된 리소시놀(4-substituted resorcinols)(Shimizu et al. (2000) Planta Med. 66:11)이다. 4-치환된 리소시놀의 구조/활성 연구는 -CH2C6H5와 같은 소수성이며 덜 부피가 큰 치환체 및 알킬기 즉, -CH2CH2CH3 이 10μM 보다 적은 IC50의 가장 큰 효능을 가짐을 나타낸다(Shimizu et al. (2000) Planta Med. 66:11). 4-치환된 리소시놀 작용의 메카니즘은 이핵성 구리 이온에서의 금속 킬레이트 효과의 어떠한 추가적인 해석 없이 DL-β-(3,4-디하이드록시페닐)알라닌(DL-dopa) 산화의 느린 결합 경쟁 저해로서 특징지워진다(Jimenez and Garcia-Carmona (1997) J. Agric. Food Chem. 45:2061). 백합과에 속하는 알로에는 많은 생물학적 활성 물질을 포함하는 복잡한 식물이다(Cohen et al. (1992) in Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects, 1st ed. W B Saunders, Philadelphia). 360종이 넘는 알로에의 대부분이 아프리카 토종으로 알려져 있다. 역사적으로, 알로에 산물은 화상, 종기(sores) 및 다른 상처의 치료를 위한 피부적용에 사용되어 왔다. 이러한 용도는 임상학적 활성을 가지는 알로에 식물로부터 화합물을 확인하려는 많은 연구에 자극이 되었다(Grindlay and Reynolds (1986) J. of Ethnopharmacology 16:117-151; Hart et al. (1988) J. of Ethnopharmacology 23:61-71). 야기 등은 알로에로부터 분리된 화합물군, 특히 티로시나아제의 효과적인 저해제인 알로에신(aloesin) 및 그것의 유도체 중의 하나인 2"-O-페룰로일알로에신(2"-O-feruloylaloesin)에 대해 밝혔다(Yagi et al. (1987) Plant Medica 515-517; Yagi et al. (1977) Z. Naturforsch 32c:731-734). C-글루코실화된 5-메틸크로몬(C-glucosylated 5-methylchromone)인 알로에신은 0.92mM의 IC50 투여량에 의존하여 인간 티로시나아제 수산화효소 활성을 저해하였으며, 또한 IC50=0.41mM을 가지는 코직산 및 IC50=3.02mM을 가지는 알부틴과 비교하여 IC50=0.70mM의 투여량에 의존하여 DOPA 산화효소 활성을 저해하였다. 알로에신에 의한 티로시나아제 효소 활성 및 필연적인 멜라닌 형성의 저해는 B16F1 쥐의 멜라노마 세포를 사용한 세포-기초 검정법에서 확인되었다. 멜라닌 생합성은 알로에신(IC50=0.167mM) 투여량에 의존하여 저해된다(Jones et al. (2002) Pigment. Cell Res. 15:335). 알로에 크로몬(aloe chromones)의 티로시나아제 저해 작용 메카니즘은 구리 이온의 감소에 관련된 것이라고 추측되었다. 천연(U.S. Pat. No. 6,451,357), 반합성(semi-synthetic)(U.S. Pat. No. 5,801,256; U.S. Pat. No. 6,083,976) 뿐만 아니라 조제된 알로에 크로몬(U.S. Pat. No. 6,123,959)은 그들의 피부 미백력으로 특허출원되었다. 아스코르브산(감귤류 과일과 같은 천연원 및 합성으로부터의 비타민 C) 및 그들의 유도체는 또한 피부 미백에 이용되어왔다. 대부분의 경우, 비타민 C는 코직산 또는 다른 티로시나아제 저해제(U.S. Pat. Nos. 4,919,921; 6,458,379 및 5,916,915)와 함께 첨가된다. 다른 보고된 피부 미백 화합물은 올리브 식물에서의 추출물(U.S. Pat. No. 6,682,763), 불포화 장쇄 지방산(U.S. Pat. No. 6,669,932), 커큐민(U.S. Pat. No. 6,641,845), 효소 추출물(U.S. Pat. No. 6,514,506), 쿠메스트롤(coumestrol)(U.S. Pat. No. 6,503,941), 하이드록실 카르복시산(U.S. Pat. No. 6,417,226; 6,365,137; 5,609,875; 5,262,153), 베타-글루칸(U.S. Pat. No. 6,251,877), 알로에 크로몬(U.S. Pat. No. 6,083,976), 페닐알라닌 화합물(U.S. Pat. No. 5,767,158), 루틴(U.S. Pat. No. 5,145,782), 에시놀(escinol)(U.S. Pat. No. 5,728,683), 살리실산(U.S. Pat. No. 5,700,784), 안지오제닌(U.S. Pat. No. 5,698,185), 머캅토덱스트란(U.S. Pat. No. 6,077,503), 엘라직 산(U.S. Pat. No. 6,066,312), 포스핀산(U.S. Pat. No. 6,280,715), 붕소 함유 화합물(U.S. Pat. No. 5,993,835), 식물 추출물(푸에라리아로부터, U.S. Pat. No. 6,352,685; 뽕나무, U.S. Pat. Nos. 6,197,304; 6,066,312 및 5,872,254; 아세로라 체리 발효물, U.S. Pat. No. 5,747,006; 퓨라논, U.S. Pat. No. 5,602,256; 및 그 외, U.S. Pat. No. 5,773,014)이다. 디아릴알칸은 천연물의 흔하지 않은 종류이다. 지금까지, CD-ROM상의 천연물 사전(the Dictionary of Natural Products)에 기재된 179,000개 이상의 천연 화합물 중에서 단지 82개만이 디아릴프로판(n=3)이다(Chapman 0026# Hall/CRC, Version 12:2 January 2004). 꾸지나무(Broussonetia papyrifera)는 뽕나무과(Moraceae family)의 낙엽성(deciduous) 나무이며, 20가지 이상의 디아릴프로판이 오로지 이 속으로부터 분리되었다(Keto et al. (1986) Chem. Pharm. Bull. 34:2448; Ikuta et al. (1986) Chem. Pharm. Bull. 34:1968; Takasugi et al. (1984) Chem. Lett. 689; Gonzalez et al. (1993) Phytochem. 32:433). 생물학적 정량으로 유도된 꾸지나무 추출물의 분류는 아로마타아제 저해 활성을 가지지 않는 4개의 디아릴프로판으로 산출되었다(Lee et al. (2001) J. Nat. Prod. 64:1286). 그러나, 동일한 식물로부터 분리된 2 프레닐화된 디아릴프로판은 몇몇의 암세포주에 대해 세포독성을 나타내며(Ko et al. (1999) J. Nat. Prod. 62:164) 브로우쏘닌 A(broussonin A)는 항진균 활성을 나타내었다(Iida et al. (1999) Yakugaku Zasshi. 119:964). 많은 수의 디아릴알칸은 또한 이리안테라(Iryanthera) 종(육두과; Myristicaceae)으로부터 분리되었다(Alvea et al. (1975) Phytochem. 14:2832; de Almeida et al. (1979) Phytochem. 18:1015; Braz et al. (1980) Phytochem. 19:1195; Diaz et al. (1986) Phytochem. 25:2395). 4개의 디하이드로칼콘(dihydrochalcones)이 항산화 활성을 보인 이리안테라 란시폴리아(Iryanthera lancifolia)로부터 분리되었다(Silva et al. (1999) J. Nat. Prod. 62:1475). 많은 수의 디아릴프로판 또한 육두과의 비롤라(Virola) 종으로부터 분리되었다(Braz et al. (1976) Phytochem. 15:567; Hagos et al. (1987) Plant Med. 53:57 Gonzalez et al. (1993) Phytochem. 32:433; Kijjoa et al. (1981) Phytochem. 20:1385; Talukdar et al. (2000) Phytochem. 53:155). 다른 디아릴프로판은 페로카르퍼스 마르수피움(Pterocarpus marsupium)(콩과; fabaceae)(Rao et al. (1984) Phytochem. 23:897; Maurya et al. (1985) J. Nat. Prod. 48:313), 린데라 움버레이트(Lindera umbellate)(녹나무과; Lauraceae)(Morimoto et al. (1985) Chem. Pharm. Bull. 33:2281), 헬리크리섬 문디(Hilichrysum mundii)(국화과; Compositae)(Bohlmann et al. (1978) Phytochem. 17:1935), 비스쿰 안굴라툼(Viscum angulatum)(겨우살이과; Loranthaceae)(Lin et al. (2002) J. Nat. Prod. 65:638), 평활근 이완효과를 가지는 아카시아 토틸리스(Acacia tortilis)(콩과; Leguminosae)로부터 분리된 것(Hagos et al. (1987) Planta Med. 53:27), 크산토케르시스 잠베시아카(Xanthocercis zambesiaca)(콩과)(Bezuidenhout et al. (1988) Phytochem. 27:2329) 및 네마 글로머라타(Knema glomerata)(육두과)(Zeng et al. (1994) J. Nat. Prod. 57:376)로부터의 세포독성 화합물들을 포함하는 천연원으로부터 분리되었다. 일본 특허 No. JP05213729A는 피부 염증, 반점(stains), 주근깨(freckles) 및 선번(sun-burn)으로부터 생기는 색소증(chromatosis)의 치료를 위한 멜라닌 저해제로서 합성 디하이드로칼콘의 용도를 알려준다. 청구된 화합물은 하기의 일반식을 가진다: 여기에서, X는 H, OH 또는 =O 로부터 선택되고; R은 H 또는 Me; 및 R1-R5는 독립적으로 H, OR 및 NH2로부터 선택된다. 따라서, 기술된 디하이드로칼콘은 페닐 고리 상의 하이드록시/메톡시 치환체 및 제2고리 상의 다섯개의 비특이적 치환체(R1-R5)를 포함한다. 청구된 조성물의 어떠한 것에서도 효소 저해는 측정되지 않았으며, 반대로 멜라닌의 저해는 UV 자극에 따른 동물 피부의 색깔 변화 및 배양된 피부 세포에서 생성된 멜라닌 양의 측정에 의해 측정되었다. 최근의 발명에서, JP05213729A에 기재된 화합물 중의 하나인 1-(4-하이드록시페닐)-3-(4'-하이드록시페닐)-1-프로판올(1-(4-hydroxyphenyl)-3-(4'-hydroxyphenyl)-1-propanol)이 합성되었고, 그것의 티로시나아제 저해능이 측정되었다. 이 화합물은 단지 티로시나아제에 대한 적당한 저해를 나타내었다(IC50=305μM, 표2). 본 발명은 독특한 치환 패턴을 가지는 신규한 디아릴알칸을 보여주며, 여기에서 적어도 2개의 방향족 고리 Ar1 또는 Ar2 중의 하나는 1-5 R' 기(R'1-R'5)으로 치환되고 여기에서 적어도 상기 R'1-R'5의 2개는 H가 아니다. 이러한 화합물은 JP05213729에 의해 알려진 화합물 보다 4-600배 더 티로시나아제의 활성을 저해하는 예상치 못한 능력을 나타낸다. 지금까지 본 발명에서의 어떠한 화합물도 간행물에 나타나 있지 않다고 여겨진다.