물질의 상호작용을 탐색하는 방법 및 키트 document_id A220623044468

일반적으로 생리활성화합물(bioactive chemical compound)은 생체내에서 단백질, 핵산, 당 또는 지질 등을 포함한 생체물질과 결합하여 이들의 기능 또는 생물학적 활성을 조절하는 화합물을 의미한다. 이러한 생리활성화합물은 유기체로부터 추출하거나 화학적 합성에 의해 수득된다. 예를 들어, 장기이식시 발생하는 면역거부반응을 경감시키기 위해 사용되는 "사이클로스포린 A"(Novartis AG) 및 "FK506"(Fujisawa)을 비롯하여 많은 항생물질들(antibiotics)이 미생물, 식물 또는 해양 생물로부터 분리되었다. 이와 같은 천연 또는 합성 생리활성화합물은 이것의 약리활성을 테스트 하고, 동물모델 및 사람 모델을 사용한 임상시험을 거쳐 하나의 신약으로 개발된다. 그러나, 천연 생리활성화합물들 중 많은 수가 그 구조의 복잡성, 정제 및 분리 기술의 한계 등의 이유로 산업적 대량 생산에 적합하지 않다. 따라서 유용한 생리활성화합물을 대량으로 생산하기 위한 방법으로서 조합화학(combinatorial chemicals) 및 새로운 유기합성법이 연구되었다(참고문헌: Schreiber, S., 2000, Target- oriented and diversity-oriented organic synthesis in drug discovery, Science 287, 1964-1969). 생체내의 단백질은 다른 단백질과 결합함에 의해 그 생물학적 기능을 나타낸다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 결합한다. 일반적으로 두 개의 단백질들 사이의 상호작용은 이들 단백질이 기능적으로 관련있음을 강하게 암시하며, 단백질의 특정부위에 특이적으로 결합하는 생리활성화합물은 그 단백질의 활성을 조절함에 의해 예컨대, 질환 관련 단백질의 경우 질환을 진단, 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있는 치료제로서의 개발가능성을 제시한다. 따라서 신약개발분야에서는 이미 그 기능 및 특성이 밝혀진 물질인 "베이트 (bait)"와 탐색 및 검출 대상이 되는 상호작용파트너인 "프레이 (prey)"의 상호작용을 확인함으로써 신규 표적단백질을 검출하거나 신약후보물질로서 생리활성물질을 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다. 현재까지 질환과 관련하여 약 500개의 표적단백질이 밝혀졌고, 향후 수년 내에 약 5,000개 이상까지 증가될 것으로 예상된다. 인간 게놈의 해석 이후, 생리활성물질이 세포내의 여러 대사 및 신호전달 과정에서 수행하는 역할에 대한 다양한 연구가 보다 급속도로 수행되었다. 화학유전체학(chemical genomics), 화학생물학(chemical biology) 및 화학단백질체학(chemical proteomics) 등의 연구분야가 나타났고, 이들은 분석디자인(analysis design), 기능유전체학(functional genomics), 단백질체학(proteomics), 자동화공학(automatic engineering) 및 생물정보학(bioinformatics) 등 다양한 기술의 발달과 관계한다. 단백질들 사이의 상호작용을 탐색하기 위한 in vitro 방법으로서, 전통적으로 생물화학적 방법 예를 들어, 교차결합(cross-linking), 방사성 표지 리간드 결합(radiolabeled ligand binding), X-선 크리스탈로그래피 및 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 친화블롯팅(affinity blotting), 면역침전법(immunoprecipitation) 및 질량분석법(mass spectrometry) 등이 개발되어 이용되었다(참고문헌: E. M. Phizicky and S. Fields, Microbiol. Rev., 59: 94-123, 1995; A. R. Mendelsohn and R. Brent, Science, 284: 1948-1950, 1999). 그러나, 이들 방법은 많은 노력이 요구되는 단백질 생산 및 분리과정을 요구하고, in vitro에서 수행되는 상호작용이므로 세포내 상호작용과 일치하는 정보를 제공하지 못한다는 단점이 있다. 삭제 이러한 단점을 극복하기 위해 몇 가지 기능적 클로닝(functional cloning) 예컨대, 이스트 투-하이브리드(yeast two-hybrid; Y2H), 이스트 트리-하이브리드(Y3H; 참고문헌: Licitra, E.J., and Liu, J.O., 1996, A three-hybrid system for detecting small ligand-protein receptor interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12817-12821), 드럭-웨스턴(drug-western; 참고문헌: Tanaka, H., Ohima, N., and Hidaka, H. 1999, Isolation of cDNAs encoding cellular drug-binding proteins using a novel expression cloning procedure: drug-western. Mol. Pharmacol. 55, 356-363), 파아지-디스플레이 클로닝(참고문헌: Sche, P.P., McKenzie, K.M., White, J.D., and Austin, D.J. 1999, Display cloning: functional identification of natural product receptors using cDNA-phage display. Chem. Biol. 6, 707-716), 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET; 참고문헌: Moshinsky DJ, Ruslim L., Blake RA, Tang F., A widely applicable, high-throughput TR-FRET assay for the measurement of kinase autophosphorylation: VEGFR-2 as a prototype. J Biomol Screen. 2003 Aug;8(4):447-52) 및 mRNA 디스플레이 클로닝 (참고문헌: McPherson, M., Yang, Y., Hammond, P.W., and Kreider, B.L., 2002, Drug receptor identification from multiple tissues using cellular-derived RNA display libraries. Chem. Biol. 9, 691-698) 등이 개발되었다. 그러나, 이들 중 이스트 투-하이브리드(yeast two-hybrid) 시스템은 게놈의 크기가 크고 복잡할 경우, 결과에 대한 신뢰도가 낮고 해석이 곤란해지므로 이를 사람에 대해 적용하는 것이 곤란하다. 또한 단백질의 원래 세포 내 분포 위치에 따라 시스템을 선택하여야 하고, 양질의 라이브러리 확보의 문제 및 세포대사 및 성장에 따라 전사활성이 영향 받을 수 있으며, 하이브리드 단백질이 독성을 나타낼 수 있다. 한편 Y3H는 생리활성 화합물과 단백질과의 상호작용에 대한 탐색이 살아있는 세포 내에서 이루어진다는 점을 특징으로 한다. 그러나, Y3H 역시 Y2H와 마찬가지로, 효모 세포와 같은 단순한 세포 내에서 수행되어야 하는 한계가 있고, 전장 막단백질(full-length membrane protein)의 분석에 적합하지 않으며, 효모의 내인성 단백질의 번역후수식(posttranslational modification) 또는 부가의 단백질 (accessory protein)이 필요한 생리활성화합물과 단백질간의 상호작용에는 적용하기 어렵다. 특히 효모 세포는 포유동물 세포와 비교하여 생리활성 화합물에 대해 유전적으로 보다 낮은 투과성을 갖는다는 문제가 있다. 그 밖에 생물정보학적 방법을 사용하여 단백질들간의 상호작용을 예측하는 생물정보학적 방법이 개발되었다. 이 방법은 데이터베이스화된 게놈 서열 정보에 기초하여 계통 분류적 또는 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 통해 단백질들간의 상호작용을 예측하는 방법이다. 또한, 구조유전체학(structural genomics), 분자 핑거프린트 (molecular fingerprint) 및 다양한 클러스터 분석 방법 등은 비교적 최근에 개발된 것으로서 버츄얼 스크리닝(virtual screening) 방법이다. 이와 같이, 단백질들 사이의 상호작용을 탐색하기 위한 많은 방법이 제안되었으나 보다 더 효과적이고 조작이 용이한 방법에 대한 요구는 지속되고 있다. 또한, 표적단백질과의 상호작용을 이용하여 생리활성 화합물을 탐색하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 예를 들어, 생화학적방법으로서, 딩 등 (Ding, S. et al.)은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 퓨린계 분자(purine-like molecules)의 라이브러리를 스크리닝 하여 P19 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 화합물을 검출하였다 (참고문헌: Ding, S., T.Y.H., Brinker, A., Peters, E.C., Hur, W., Gray, N.S., and Schultz, P.G. 2003, Synthetic small molecules that control stem cell fate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 7632-7637). 그러나, 이 방법은 친화력이 매우 높아야만 탐색에 적용할 수 있다는 단점이 있으며, 표적단백질이 다량 존재하여야 효과적인 검출이 가능하다. 또한 대부분의 생리활성화합물은 소수성(hydrophobic)으로서 수용성 환경에서 목적하는 표적 단백질과 경쟁적으로 결합하므로, 생리활성 화합물을 고정화시킨 아가로스(agarose) 또는 다른 지지체에 검출대상의 추출물을 통과시키는 경우, 단백질은 특이적 결합파트너 뿐만 아니라 비특이적 결합파트너와도 결합을 형성한다. 따라서 이 방법의 경우 친화력이 낮은 결합분자를 제거하기 위한 세척 단계가 필수적으로 요구된다. 삭제 삭제 이와 같은 생화학적 방법의 단점을 극복하기 위해 유전적 방법이 제안되었다. 쟁 등(Zheng et al.)은 이형접합체(heterozygote) 및 숙주에서 증가된 약물 감수성을 탐색하기 위해 이스트 트리-하이브리드 시스템을 이용하였다. 이러한 유전적 방법의 가장 큰 장점은 표현형과 유전형 사이의 강력한 연관성이다. 즉, 이 시스템을 이용한 탐색 결과 발견되는 하나의 히트는 표적단백질에 대한 유전자의 클론을 직접적으로 제공한다(참고문헌: Jaeger, S., Eriani, G., and Martin, F. 2004, Results and prospects of the yeast three-hybrid system. FEBS Lett. 566, 7-12). 이 시스템에서는 신규 표적단백질 후보가 다가 단백질 복합체의 일부로서 융합되어 이용될 수 있다. 그러나, 이 시스템은 이스트에 한정되어 이용되어야 한다는 단점이 있다. 화학유전학은 유전자 돌연변이(mutations)가 세포에 미치는 영향을 나타내기 위해 생리활성 화합물을 이용하는 것으로서, 화합물군 또는 조합 라이브러리(combinatorial library)로부터 목적하는 활성화합물을 동정한다 (참고문헌: Schreiber, S.L. 2003, The small molecule approach to biology. Chem. ＆ Eng. 1199 News 81, 51-61; Crews, C.M., and Splittgerber, U. 1999, chemical genetics: exploring and controlling cellular processes with chemical probes. Trends Biochem. Sci. 24, 317-320). 이 방법은 통상 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에, 목적하는 표현형을 탐색하기 위해 유전자 조작된 세포와 함께 수백 내지 수천 개의 화합물을 배열함에 의해 수행된다(참고문헌: Clemons, P.A., Koehler, A.N., Wager, B.K., Springs, T.G., Spring, D.R., King, R.W., Schreiber, S.L., and Foley, M.A. 2001, A one-bead, one-stock solution approach to chemical genetics: part 2. Chem. Biol. 6, 71-83). 예를 들어, 목적하는 결과가 특정 유전자 또는 유전자 군의 발현을 유발시키는 것일 경우, 세포는 녹색형광단백질(GFP) 또는 다른 상용 마아커(marker)의 발현을 유발하는 관련된 프로모터(promoter)가 삽입된 리포터 구성물을 포함한다. 그러나, 이 방법 역시 다음과 같은 두 가지의 커다란 문제점이 있는 것으로 밝혀졌다: 첫째, 화학유전학은 미량의 nM 단위에서 작용하는 생리활성 화합물을 탐색하기에 적합하지 않다. 둘째, 이 방법은 전형적으로는 수십만 개 물질에 대한 스크리닝을 통해 불과 몇 개의 활성물질을 찾아낼 수 있다. 상기한 바와 같이, 단백질들 사이의 상호작용을 탐색하거나 단백질과 생리활성 화합물 사이의 상호작용을 탐색하기 위한 종래기술은, 대부분 in vitro에서 수행되거나 효모 또는 박테리아 등 제한된 세포 내에서만 수행 될 수 있으며, 유전자 조작 및 발현의 과정을 거쳐야 하므로 DNA의 크기에 제한되고, 그 밖에 다른 매개변수로 인한 높은 위양성률(false positive hit rate)로 인하여 검출된 결과의 신뢰도가 떨어진다. 이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점들을 극복하고, in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서 생리활성물질들의 상호작용을 실시간 역동적으로 탐색하기 위해 연구한 결과, 자기장에 의해 이동할 수 있는 자성을 나타내는 물질 또는 자성물질을 포함하는 입자(magnetic-material/-particle)에 생리활성물질을 결합시키고, 탐색을 위한 표지물질이 결합된 다른 생리활성물질을 세포 내로 도입한 다음, 세포에 자기장을 인가하고 자기장 하에서 이동된 표지의 위치를 측정하여 이들 생리활성물질들 사이의 결합여부를 탐색, 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.