ｃ-ＭＥＴ 키나제 결합 단백질 document_id A220623050760

간세포 성장 인자/분산 인자(HGF/SF)는 간충직 (mesenchyme) 유래의 다면발현성(pleiotropic) 인자로서 세포 성장, 세포 이동 및 각종 세포의 형태 발생을 조절하고, 배아 세포의 전개 및 유기발생 과정에서 형태발생 조직간 상호작용에 대응하는 상피세포-간충직 간의 상호작용을 중재한다. HGF 는 최초에 간세포의 잠재 유사분열물질 (mitogen)로 확인되었지만, 그 외에도 또한 맥관 형성 성장 인자라고 동정되었다. Met는 1980 년대에 처음 온코겐으로 확인되었으며 HGF 수용체이다. 프로토-온코겐 c-MET 는 수용체 티로신 키나제를 코드화하는 것으로 발견되었다. HGF 처리에 반응하여, 다음과 같은 다양한 활성이 관찰된다: 수용체의 포스포릴화 반응, 신호발생 중간체 Gab-1/Grb2 의 도킹, P13K, ERK 1 및 2, 및 AKT 같은 키나제 활성화의 종결 등이다. 이러한 활성은 세포 성장, 생존, 이동 및 신생혈관 생성 (neovascularisation) 등에 도움을 준다. 수용체 티로신 키나제 Met 및 그의 리간드 간세포 성장인자/스캐터 인자(HGF/SF)의 부적절한 발현이나 신호 발생은 광범위한 인간 종양에 있어서 공격적 표현형 및 나쁜 임상적 예후와 연루되어 있다. 네 가지의 확인된 세포주가 암에 대한 c-MET 의 역할과 밀접한 관련이 있다 : 첫째로, HGF 및/또는 MET를 전위적(ectopically)으로 과발현하는 생쥐와 인간 세포주는 무갑상선 생쥐(athymic nude mice)에서 종양발생형 혹은 전이형이 된다. 둘째로, 인간 종양 세포에서의 MET 또는 HGF 발현의 하향 조절시 상기 종양 발생 잠재력을 감소시킨다. 수용체나 리간드를 형질전환 유전자로서 발현하는 생쥐 모델은 각종 종양 및 전이성 종양을 발생시킨다. 셋째로, 수많은 연구 결과, HGF 및/또는 MET는 암 및 기타 종류의 인간 종괴 및 이의 전이성 종양에서 충분히 발현하며 HGF 및/또는 MET의 과잉발현 또는 오발현(misexpression)은 나쁜 예후와 상호 관련이 있는 경우가 많다. 넷째로, 산발적 및 유전적 형태의 인간 신장 유두상 암으로 발견된 활성적인 돌연변이로부터, 암에 MET를 관련시키는 명백한 증거를 얻는다. 발명의 요약 본 발명은 c-MET 에 결합하는 단량체 도메인을 가진 폴리펩티드를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 단량체 도메인은 30 내지 50 개의 아미노산으로 이루어진 비-자연발생적 단량체 도메인으로서 ; 적어도 하나의 이황화물 결합을 포함하고 ; 선택적으로, 이온에 결합된다. 또다른 실시형태에서, 상기 단량체 도메인은 LDL 수용체 A 형 단량체 도메인이다. 또다른 실시형태에서, 상기 단량체 도메인은 다음의 서열을 가진 LDL 수용체 A 형 단량체 도메인이다: 여기에서 X 는 모든 아미노산이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 c-MET 에 결합하는 적어도 하나의 단량체 도메인 및 단지 6 개의 단량체 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, c-MET 에 결합하는 폴리펩티드는 2 개 이상의 단량체 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 또한 혈액 인자에 대한 결합특이성을 가진 제 2 의 단량체 도메인을 포함하며 따라서, 폴리펩티드가 동물에 주입되면 혈액 인자-결합 단량체 도메인이 결핍된 폴리펩티드의 혈청 반감기와 비교하여 상대적으로 이것의 혈청 반감기를 증대시킨다. 몇몇 실시형태에서, 제 2 단량체 도메인은 면역글로불린(IgG)에 결합되고 상기 제 2 단량체 도메인은 다음으로부터 선택된 서열을 가진 LDL 수용체 A 형 단량체 도메인이며 : 여기에서 X 는 모든 아미노산이다. 몇몇 실시형태에서, 제 2 단량체 도메인은 면역글로불린(IgG)에 결합되고 상기 제 2 단량체 도메인은 다음의 서열을 가진 LDL 수용체 A 형 단량체 도메인이며 ; 여기에서 X 는 모든 아미노산이고, 괄호안의 아미노산은 단일 위치의 또다른 아미노산이다. 몇몇 실시형태에서, 제 2 단량체 도메인은 다음을 포함한다 : 몇몇 실시형태에서, 제 2 단량체 도메인은 다음을 포함한다 : 몇몇 실시형태에서, c-MET 에 대한 하나 이상의 단량체 도메인의 결합은 MET의 이량체화를 저해한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 단량체 도메인이 c-MET 의 세마(sema) 도메인에 결합되고 따라서 c-MET 에 대한 MET 리간드의 결합을 방해한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 하나 이상 및 6 개 이하의 단량체 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 2 개 이상의 단량체 도메인을 포함하며 상기 단량체 도메인은 링커에 의해 링크되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 4 내지 12 개의 아미노산 길이이다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 도메인은 각각 35 내지 45 개의 아미노산으로 되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 각 단량체 도메인은 2 개의 이황화물 결합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각 단량체 도메인은 3 개의 이황화물 결합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이 이온은 금속 이온이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이온은 칼슘 이온이다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 단량체 도메인은 LDL-수용체 A 도메인로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 단량체 도메인은 EGF-유사 도메인으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 단량체는 서열내 10 % 이상의 아미노산이 시스테인이고 ; 및/또는 25 % 이상의 아미노산이 비-자연발생적 아미노산인 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 c-MET 에 결합된 폴리펩티드를 확인하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 이 방법은 c-MET 에 대한 친화성을 위해 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하는 단계 ; 및 c-MET 에 결합하는 하나 이상의 단량체 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함하고, 상기의 단량체는 비-자연발생적 단량체 도메인이며 ; 하나 이상의 이황화물 결합을 포함하고 ; 또한 이온에 결합되는 것을 특징으로 한다. 몇몇 실시형태에서, 선택된 폴리펩티드는 다음을 포함하는 단량체 도메인이다 : 몇몇 실시형태에서, 선택된 단계는 HGF-중재된 세포 증식 및/또는 이동을 감소시키는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 동물의 종양 성장을 방해하는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 도메인은 서열내 10 % 이상의 아미노산이 시스테인이고 ; 및/또는 25 % 이상의 아미노산이 비-자연발생적 아미노산인 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 선택된 폴리펩티드의 단량체 도메인을 제 2 단량체 도메인에 연결하여 다량체의 라이브러리를 형성하고 각 다량체는 2 개 이상의 단량체 도메인을 포함하는 단계 ; c-MET 에 대한 결합력에 관하여 다량체 라이브러리를 스크리닝하는 단계 ; 및 c-MET 에 결합하는 다량체를 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 또한 선택된 폴리펩티드의 단량체 도메인을 제 2 단량체 도메인에 연결하여 다량체의 라이브러리를 형성하고 각 다량체는 2 개 이상의 단량체 도메인을 포함하는 단계 ; c-MET 이외의 표적 분자에 대한 결합력에 관하여 다량체 라이브러리를 스크리닝 하는 단계 ; 및 상기 표적 분자에 결합할 다량체를 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 또한, 하나 이상의 단량체 도메인을 돌연변이시키고, 이 돌연변이된 단량체 도메인을 포함하는 라이브러리를 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 단량체 도메인의 라이브러리는 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 세포면 디스플레이로 발현된다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 적어도 2 개의 단량체 도메인을 포함하며 이 도메인은 링커에 의해 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 펩티드 링커이다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 4 내지 12 개의 아미노산 길이이다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 도메인은 각각 35 내지 45 개 아미노산을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 각 단량체 도메인은 2 개의 이황화물 결합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각 단량체 도메인은 3 개의 이황화물 결합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이온은 금속 이온이다. 몇몇 실시형태에서 상기 이온은 칼슘 이온이다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1 개의 단량체 도메인은 LDL-수용체 클래스 A 도메인으로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 단량체 도메인은 EGF-유사 도메인으로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 단량체 도메인은 서열내 10 % 이상의 아미노산이 시스테인이고 ; 및/또는 25 % 이상의 아미노산이 비-자연발생적 아미노산인 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 c-MET 에 결합하는 단량체 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드로서, 상기 단량체 도메인은 : 30 내지 50 개의 아미노산으로 이루어진 비-자연발생적 단량체 도메인이고 ; 하나 이상의 이황화물 결합을 포함하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 면역글로불린-G(IgG)에 결합하는 단량체 도메인을 포함하고, 상기 단량체 도메인은 다음 중에서 선택된 서열을 갖는 LDL 수용체 A 형 단량체 도메인이고 ; 여기에서 X 는 모든 아미노산이고 괄호 속의 아미노산은 단일 위치에 있는 또다른 아미노산이며 ; 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드가 주입될 때, IgG 에 결합되는 단량체 도메인이 결핍된 폴리펩티드의 혈청 반감기와 비교할 때 더 증가된 혈청 반감기를 갖는 것이다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 도메인은 다음을 포함한다 : 몇몇 실시형태에서, 단량체 도메인은 다음을 포함한다 : 몇몇 실시형태에서, 폴리펩티드는 IgG 이외의 분자에 대한 결합 특이성을 가진 제 2 단량체 도메인을 포함하며 상기 제 2 단량체 도메인은 : 30 내지 100 개의 아미노산을 갖고 ; 비-자연발생적 단량체 도메인이며 ; 하나 이상의 이황화물 결합을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 제 2 단량체 도메인은 비-자연발생적 LDL-수용체 클래스 A 도메인이다. 본 발명은 또한 상술한 바와 같이 폴리펩티드를 코드화할 폴리누클레오티드를 제공한다. 정의 별도의 언급이 없으면 다음의 정의는 선행 기술에 따른 정의로 대신한다. "MET" 는 "c-MET" 라고도 하며 간세포 성장인자/스캐터 인자(HGF/SF) 결합 수용체 티로신 키나제를 말한다. HGF 처리에 반응하여, 다음과 같은 다양한 활성이 관찰된다 : 수용체의 포스포릴화 반응, 신호발생 중간체 Gab-1/Grb2 의 도킹, P13K, ERK 1 및 2, 및 AKT 같은 키나제 활성화의 종결 등이다. 이러한 활성은 세포 성장, 생존, 이동 및 신생혈관 생성 등에 도움을 준다. (Birchmeier 등의 Mol Cell Biol. 4:915-925 (2003) 참조). MET의 아미노산 서열은 공지되어 있으며 서열 번호 No.1 로 표시한다(Part 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(18): 6379 (1987) 참조). "단량체 도메인" 이나 "단량체" 는 상호 교환적으로 지칭하며 단백질 또는 폴리펩티드에서 발견되는 개별 도메인을 말한다. 단량체 도메인은 자연 아미노산 서열의 측면 배치가 없는 용액내의 자연적인 3 차원 구조를 형성한다. 본 발명의 단량체 도메인은 표적 분자에 대해 결합되는 경우가 잦다. 예를 들면, 표적 분자에 결합하는 3 차원 구조를 형성하는 폴리펩티드는 단량체 도메인이다. 언급한 바와 같이, "단량체 도메인" 은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하지 않는다. "루프" 는 단량체 도메인 단백질의 골격구조의 조립에 의해 환경에 정상적으로 노출되고 표적 결합에 수반되는 단량체 도메인의 일부를 말한다. 본 발명은 구체적인 특징, 예를 들어, 이황화 결합 가능성, 2 차 단백질 구조간의 결합, 및 분자의 운동성(즉, 유연성) 등에 의해 확인되는 3 가지 루프 종류를 제공한다. 3 가지 종류의 루프 서열은 시스테인-정의된 루프 서열, 구조-정의된 루프 서열 및 B-인자-정의된 루프 서열이다. 여기서 "시스테인-정의된 루프 서열" 이란, 동일한 종에서 하나 이상의 다른 자연발생적 단량체 도메인에 관하여 보존된 시스테인 잔기(residue)가 각 말단에 결합된 자연발생적 단량체 도메인-코드화 서열의 부서열(subsequence)을 말한다. 시스테인-정의된 루프 서열은 상기 자연발생적 단량체 도메인의 복수의 서열 정렬에 의해, 보존된 시스테인 잔기를 확인하기 위한 서열 분석법에 따라 확인된다. 시스테인-정의된 루프 서열은 각 말단에 인접한 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 시스테인-정의된 루프 서열을 가진 단량체 도메인은 LDL 수용체 A 도메인, EGF-유사 도메인, 스시(sushi) 도메인, 피브로넥틴 제 1 형 도메인 등을 포함한다. 따라서, 예를 들면, CX6CX4CX6CX5CX8C (SEQ ID NO: 18)로 나타내고 이 때의 X6, X4, X5 및 X8 가 각각 소정 개수의 아미노산을 포함하는 시스테인-정의된 루프 서열을 나타내는 LDL 수용체 A 도메인의 경우, 소정 개수의 아미노산을 갖는다. 본원에서 사용된 "구조-정의된 루프 서열" 은 각 말단에서 각각 2 차 구조를 형성할 부서열에 결합된 단량체 도메인 코드화 서열의 부서열이다. 공지의 3 차원 구조를 가진 단백질의 2 차 구조는 Frishman, D. 및 Argos, P.(1995)의 문헌 "Knowledge-based secondary structure assignment" Proteins, 23(3):566-79(또한 인터넷 웹사이트 //hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Option/strid.html 을 참조한다)에 기술된 바와 같은 단백질 2 차 구조 할당을 위한 알고리즘 STRIDE 에 따라 확인된다. 알 수 없거나 특징화되지 않은 3 차원 구조를 가진 단백질의 2 차 구조는 Jones, D.T.(1999)의 문헌 "Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices", J.Mol.Biol. 292:195-202(또한 McGuffin, L.J. Bryson, K., Jones, D.T.(2000), "The PSIPRED protein structure prodiction server," Bioinformatics, 16:404-405, 및 인터넷 웹사이트 //bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred 를 참조한다)에 기술된 바와 같은 알고리즘에 따라 확인된다. 2 차 구조는 예를 들어, 병풍 구조(pleated sheet), 나선형 구조 등을 포함한다. 구조-정의된 루프 서열을 갖는 단량체 도메인의 예는 C2 도메인, Ig 도메인, 팩터 5/8C 도메인, 피브로넥틴 제 3 형 도메인 등이다. "B-인자 정의된 루프 서열" 은 B-인자 정의된 루프에 들어있는 알파 탄소에 관한 B-인자가 전체 단량체 도메인의 최고 25 % 알파 카본 B-인자 중에 해당하는 단량체-도메인 코드화 서열의 3 개 이상의 아미노산 잔기의 부서열을 뜻한다. 통상적으로, 상기 부서열에 관한 평균 알파 탄소 B-인자는 약 65 이상이다. 여기서, "B-인자" 란(혹은 "온도 인자" 나 "Debye-Waller 인자")라는 용어는 X-선 분산 데이타로부터 유래된다. B-인자는 각 원자 혹은 원자들의 그룹에 대해 X-선 분산 기간에 적용될 수 있고, 또한 본 발명의 실행시 이용되는 B-인자에 대한 전자 밀도 분포도가 이방성 또는 비이방성 일 수 있음을 설명하는 인자이다. "평균 알파-탄소 B-인자" 는 다음과 같고 : 여기에서 n 은 루프에 있는 잔기의 수에 상응하며 적어도 3 이고 또한, B-factorCαi 는 루프의 아미노산 잔기 i 의 알파 탄소에 대한 B-인자이다. "다량체" 는 2 개 이상의 단량체 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 가리킨다. 다량체에 들어있는 단량체 도메인은 링커와 함께 접합할 수 있다. 다량체는 조합성 모자이크 단백질 또는 재조합 모자이크 단백질로 공지되어 있다. "군(family)" 및 "군 클래스(family class)" 란 상호 교환적으로 지칭하며 아미노산 서열에서의 유사성에 기초하여 함께 그룹으로 묶을 수 있는 단백질을 가리킨다. 유사한 서열들은 단백질의 기능 및/또는 단백질의 3 차원 구조의 유지에 있어서 중요하므로 대체로 보존된다. 이러한 종의 예를 들면, LDL 수용체 A 형 종류, EGF-유사 종류 등을 포함한다. 부가적으로, 동일한 표적 분자에 결합하는 관련 서열은 공통의 서열 모티프(motif)에 기초한 종류로 분류될 수 있다. "리간드" 는 또한 "표적 분자" 라고도 하며 단일 분자 내지 복합 표적에 이르는 다양한 종류의 물질 및 분자를 말한다. 표적 분자는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 또는, 폴리펩티드 도메인에 의해 인지될 수 있는 기타의 분자일 수 있다. 예를 들면, 표적 분자는 화학적 화합물(즉, 예를 들어, 유기 분자, 무기 분자, 또는 유기 및 무기 원자를 가진 분자 등의 비생물학적 화합물, 단 폴리누클레오티드 및 단백질을 제외한다), 화학적 화합물의 혼합물, 공간적 국소화된 화합물의 박테리오파지 펩티드 어레이, 생물학적 거대분자, 박테리오파지 펩티드 디스플레이 라이브러리, 폴리좀 펩티드 디스플레이 라이브러리, 또는 박테리아, 식물, 진균 또는 동물(예, 포유류) 세포나 조직같은 생물학적 물질로 된 추출물, 단백질, 독소, 펩티드 호르몬, 세포, 바이러스 등을 포함할 수 있다. 다른 표적 분자는 예를 들면, 전체 세포, 전체 조직, 관련 혹은 무관련 단백질의 혼합물, 바이러스 혹은 박테리아 균주의 혼합물 등을 포함한다. 표적 분자는 또한 스크리닝 분석에서의 세포함유물로 정의되거나 또는 특이적 단백질 상호작용(즉, 선별적으로 두개의 예정 폴리펩티드 사이에서 일어나는 결합 상호작용을 억제시키는 작용)의 향상제 또는 억제제에 의해 한정될 수 있다. 여기서 "링커" 는 2 개 이상의 개별 분리 단량체 도메인을 접합 또는 연결시키는 성분 또는 성분들의 그룹을 가리킨다. 링커는 개별 분리 단량체 도메인이 다량체 속에 함께 접합되었을 때 여전히 분리 상태로 남도록 만든다. 적절한 링커는 폴리펩티드, 폴리 핵산, 펩티드 핵산 등을 포함한다. 적절한 링커는 또한 선택적으로, 하나 이상의 산호 원자를 탄소 골격 속에 함입된 상태로 갖는 치환 알킬렌 성분을 포함한다. 전형적으로 링커의 분자량은 약 2000 달톤 미만이다. 더 구체적으로, 링커의 분자량은 1500 달톤 미만이고 대체로 약 1000 달톤 미만이다. 링커는, 예를 들어, 다량체 내의 개별 분리 단량체 도메인 각각이 개별 결합 위치를 통해 동일한 표적 분자에 결합되는 경우 개별 분리 단량체 도메인이 서로 공조하기에 충분할 정도로 작은 크기를 가질 수 있다. 예시적인 링커는 폴리펩티드를 코드화할 폴리누클레오티드, 또는 아미노산의 폴리펩티드나 기타 비-자연발생적 성분을 포함한다. 링커는 자연 서열, 그의 변이체 또는 합성 서열의 일부일 수 있다. 링커는 예를 들면, 자연발생적 비-자연발생적 아미노산 혹은 그의 조합물을 포함할 수 있다. "개별" 이란 용어는 독립적이고 또한, 예를 들면, 다른 단량체 도메인을 포함한 다른 성분들과 복합되어도 여전히 독립 상태로 유지되는 성분의 성질을 가리키는 것이다. 단량체 도메인은 단백질로부터 인지 및 분리될 수 있는 독립성을 가지므로 단백질 내의 개별 도메인이다. 예를 들면, LDLR 내의 A 도메인의 리간드 결합력은 독립적인 성질이다. 각각의 도메인의 다른 예는, 링커에 의해 다량체 내에서 서로 복합 또는 접합될 때에도, 여전히 개별 독립 도메인으로 남아있는 다량체 내의 개별 단량체 도메인을 포함한다. 개별성의 또다른 예는 리간드를 위한 다량체 내의 개별 결합 위치이다. 여기서, "지시된 진화(directed evolution)" 는 폴리누클레오티드 변이체가 회귀 과정에서 생성, 발현 및 활성도(예, 결합 활성을 가진 폴리펩티드)에 관하여 스크리닝이 행해지는 과정을 말한다. 하나 이상의 스크리닝 대상을 선택하고, 선별된 대상을 코드화하여 새로운 변이체를 생성할 폴리누클레오티드를 이용하여 상기 과정을 반복한다. 지시된 진화는 2 회전 이상의 변형 세대를 수반하며 3, 4, 5, 10, 20 회전 또는 그 이상의 변형 세대 및 선별을 포함한다. 변형은 당해 분야의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 실수유발(error-prone) PCR 법, 유전자 재조합법, 화학 돌연변이 등을 포함한 방법에 의해 발생할 수 있다. 여기서의 "셔플링(shuffling)" 은 비확인 서열 간의 재조합을 가리킨다. 몇몇 실시형태에서, 서플링은 cre/lox 및/또는 flp/frt 계 등의 유사 재조합 또는 비-유사 재조합을 통한 교차(crossover)를 포함할 수 있다. 셔플링은, 예를 들어, 체외 및 체내 셔플링 포맷(format), 인실리코(in silico) 셔플링 포맷, 이중나선 또는 단일나선 탬플릿을 이용하는 셔플링 포맷, 프라이머계 셔플링 포맷, 핵산 분절화 기초의 셔플링 포맷 및 올리고누클레오티드 중재의 셔플링 등과 같이 비확인 서열 간의 재조합에 기초하고 또한 하기에서 상세히 설명되는 바와 같은 포맷, 또한 기타의 유사한 재조합계 포맷을 포함한 각종 상이한 포맷을 이용하여 실행할 수 있다. 여기서의 "무작위" 는 2 개 이상의 아미노산으로 구성되고 확률무작위(stochastic and random) 방법으로 구축된 아미노산 서열 또는 폴리누클레오티드 서열을 뜻한다. 랜덤 폴리누클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 프레임워크 또는 스카폴딩 모티프를 포함할 수 있고, 또한 불변 서열을 포함할 수 있다. 여기서의 "의사무작위(pseudorandom)" 는 한계 가변성을 가진 폴리누클레오티드나 폴리펩티드 서열 집단에 관한 것이며 따라서, 일부 위치에서는 잔기 변형도가 제한되어 있으나 의사무작위 위치에서는 잔기 변형이 가능하다. 여기서의 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 서로 상호 교환적으로 지칭되며 2 개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 뜻한다. "아미노산" 은 자연발생적 및 합성 아미노산, 아미노산 유사체, 자연발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체를 말한다. 자연발생적 아미노산은 유전자 코드에 의해 코드화된 것, 추후 변형될 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, O-포스포세린 등을 말한다. 아미노산 유사체는 자연발생적 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조, 예를 들어, 수소에 결합된 α탄소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기를 가진 것으로서, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄 등과 같은 화합물을 말한다. 이러한 유사체는, 예를 들어, 변형 R 기를 갖거나(예, 노르류신), 변형 펩티드 골격을 갖지만 자연발생적 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 지속 유지한다. "아미노산 모방체" 는 아미노산의 일반적인 화학구조와 다른 구조를 갖지만 자연발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 말한다. "보존성 아미노산 치환" 은 유사한 측쇄를 가진 잔기의 상호교환성을 말한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가진 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며 ; 지방족-히드록실 측쇄를 가진 아미노산 그룹은 세린과 트레오닌 ; 아미드 함유 측쇄를 가진 아미노산 그룹은 아스파라긴과 글루타민 ; 지방족 측쇄를 가진 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 ; 염기성 측쇄를 가진 아미노산 그룹은 시스테인과 메티오닌이다. 바람지한 보존성 아미노산 치환기는 : 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라진-글루타민이다. "핵산 서열" 이라는 문장은 5' 내지 3' 말단에서 판독되는 데옥시리보누클레오티드나 리보누클레오티드 염기의 단일 또는 이중나선 고분자를 말한다. "코드화" 란 하나 이상의 아미노산을 코드화 하는 폴리누클레오티드 서열을 말한다. 시작 또는 정지 코돈을 포함할 필요는 없다. 아미노산 서열은 폴리누클레오티드 서열이 제공한 6 개의 상이한 판독 프레임 중 임의의 하나에 코드화될 수 있다. "프로모터" 는 RNA 폴리머라제의 인지 및 결합에 수반된 전사의 시작부터 상류 또는 하류에 위치한 구역이나 서열, 및 전사를 개시하는 다른 단백질을 말한다. "벡터" 는 숙주 염색체와 독립될 때 숙주 기관에서 복제할 수 있는 폴리누클레오티드를 말한다. 벡터의 예는 플라스미드를 포함한다. 벡터는 통상적으로 복제의 기원을 갖는다. 벡터는 예를 들어, 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 특별한 핵산의 발현 조정을 위한 프로모터를 포함할 수 있다. "재조합" 은 참조로 예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대해 쓰이는 용어로서, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산이나 단백질의 도입 또는 자연 핵산이나 단백질의 변화에 의해 변형된 것 또는, 상기 세포가 상기 변형된 세포로부터 유래되는 것을 말한다. 그래서, 예를 들어, 재조합 세포는 자연(비-재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 비정상적으로 발현되거나 발현되기 전이나 혹은 전혀 발현되지 않은 자연 유전자를 발현한다. "특이적으로(또는 선택적으로) 결합하는" 이라는 문장은 단량체나 다량체에 관련하여, 이종 단백질 집단(예, 세포나 조직 용해질) 및 기타 생물 제제 내의 폴리펩티드 존재 여부를 측정할 수 있는 결합 반응을 말한다. 따라서, 항체 결합 분석에 이용된 표준 조건이나 분석하에, 특이화된 단량체 또는 다량체는 상기 조건 이상(예, 상기 조건의 2X, 5X, 10X 이상)에서 특정의 표적 분자에 결합하며 시료에 존재하는 다른 분자들에 대해 대량으로 결합하지 않는다. 2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이라는 표현은 서로 동일한 2 개 이상의 서열이나 부서열을 뜻한다. "실질적으로 동일한" 이란, 비교 창 또는 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 측정하거나 수조작 정렬 및 육안 검사를 통해 정의된 구역에서 최대 대응도에 관하여 비교 및 정렬할 경우, 서로 동일한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 특정 비율(즉, 60 % 동일성, 경우에 따라, 특정 구역에서 또는 특이적이 아닌 경우 전체 서열에 대해 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % 또는 95 % 동일성)로 갖는 2 개 이상의 핵산이나 폴리펩티드 서열을 말한다. 경우에 따라, 동일성이나 실질적인 동일성은 약 50 이상의 누클레오티드 길이를 갖는 구역, 또는 더 바람직하게 100 내지 500 또는 1000 이상의 뉴클레오티드나 아미노산의 길이를 갖는 구역을 말한다. 폴리누클레오티드 또는 아미노산 서열은 2 개의 서열이 자연발생적 서열에서 확인된 것과 동일한 방식으로 접합되지 않는 경우 제 2 의 서열에 대해 "이종성" 이다. 예를 들면, 이종성 코딩 서열에 조절 접합된 프로모터는 자연발생적 대립유전자 변이체와 상이한 코딩 서열을 말한다. 다량체에 관련하여 사용되는 "이종성 링커" 라는 표현은 성질 측면에서 서로 동일한 관계성이 없는 단량체와 링커를 포함한다(예, 이들은 비-자연발생적 융합 단백질을 형성한다). 단백질 서열 내의 "비-자연발생적 아미노산" 이란, 비교 창가 피시험 단량체 도메인의 길이를 갖고 하기 설명에서와 같은 BLAST 2.0 을 사용하는 유전자은행의 비-중복성("nr") 데이타베이스 내에서 자연발생적 서열과 비교할 때, 최소합계 및 확률을 갖는 자연발생적 폴리펩티드의 정렬에서 대응 위치에서 발생하는 아미노산 이외의 다른 아미노산을 말한다. "서열 동일성의 백분율" 은 2 개의 최적 정렬된 서열을 비교 창에서 비교하여 측정하며 비교 창 내의 폴리누클레오티드 서열의 일부가 기준 서열(추가 또는 삭제부가 없는)과 비교시 추가 또는 삭제부(틈새 형성)를 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기나 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 개수를 측정하여 이에 대응된 위치의 개수를 구하고, 이어서 상기 대응된 위치의 개수를 비교 창 내의 위치 총개수로 나누고 이 결과값에 100 을 곱하여 서열 동일성을 백분율 단위로 구할 수 있다. 2 개 이상의 핵산이나 폴리펩티드 서열에 관련하여 "동일한" 이나 "동일성" 백분율이라는 표현은, 비교 창 또는 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 측정하거나 수조작 정렬 및 육안 검사를 통해 정의된 구역에서 최대 대응도에 관하여 비교 및 정렬할 경우, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기나 누클레오티드를 소정 백분율값으로 갖는 2 개 이상의 서열 또는 부서열을 뜻한다. 이러한 서열은 따라서 "실질적으로 동일한" 것이라고 한다. 이 정의는 또한 피시험 서열의 상보체(complement)를 뜻하기도 한다. 어떤 경우, 동일성은 약 50 개 이상의 아미노산이나 누클레오티드 길이, 또는 더 바람직하게 75 내지 100 개의 아미노산이나 누클레오티드 길이의 구역에 적용된다. 서열 비교에서, 하나의 서열이 기준 서열 역할을 하고 이것에 대해 시험 서열을 비교하는 것이 일반적이다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때 시험 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고 필요시 서열 좌표를 한정한 뒤 서열 알고리즘 프로그램 변수들을 정의한다. 디폴트 프로그램 변수를 사용하거나 또다른 변수들을 정의할 수도 있다. 서열 비교 알고리즘은 따라서, 프로그램 변수에 기초하여 기준 서열에 대한 시험 서열의 동일성을 백분율 단위로 계산할 수 있다. 여기서의 "비교 창(comparison window)" 은 20 내지 600, 대개는 50 내지 200, 더 일반적으로는 약 100 내지 150 개로 이루어진 군에서 선택된 연속 위치의 개수 중 어느 하나의 절편에 관한 기준을 포함하며, 상기 위치 속에 2 개의 서열이 최적 배열된 후 한 서열을 동일한 개수의 연속 위치의 기준 서열과 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬법은 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어, Smith and Waterman(1970)의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482c), Needleman and Wunsch(1970)의 상동성 정렬 알고리즘(J. Mol. Bilol. 48:443), Pearson and Lipman(1988)의 유사성 검색법(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 이들 알고리즘의 컴퓨터 계산처리(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 알고리즘 및 육안 검사법(예, Ausubel 등의 Current Protocols in Molecular Biology(1995 보정) 참조) 을 이용하여 실시할 수 있다. 유용한 알고리즘의 한가지 예는 BLAST 2.0 알고리즘으로서, Altschul 등의 (1990)(J. Mol. Biol. 215:403-410)에 개시되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명과학 정보센터를 통해 통용되고 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 이 알고리즘은 첫째로, 데이타베이스 서열 내의 동일 길이의 단어와 함께 정렬했을 때 양의 임계 스코어 T 에 대응하거나 이를 만족하는 대상 서열의 길이 W 의 짧은 단어를 확인함으로써 하이 스코어 서열쌍(HSPs)을 확인하는 것을 포함한다. T 는 이웃 단어 스코어 임계값이라고 한다(Altschul 등의 상기 참조). 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이들을 함유한 더 긴 HSPs 를 발견하기 위한 검색 개시의 시드(seed)가 된다. 상기 단어 히트는 축적되는 정렬 스코어가 증가하는 동안 계속 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 축적 스코어는 누클레오티드 서열의 경우 변수 M(한쌍의 조합 잔기에 대한 보상 스코어 ; 항상 0 보다 크다) 및 N(부조합 잔기에 대한 페널치 스코어 ; 항상 0 보다 작다)를 이용하여 계산한다. 아미노산 서열에서, 스코어링 매트릭스는 축적 스코어 계산에 이용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 : 축적 정렬 스코어가 최대 달성치로부터 X 의 양만큼 감소할 때 중지되고 ; 하나 이상의 음성 스코어 잔기 정렬의 축적으로 인해 상기 축적 스코어가 0 이하가 되거나 ; 또는 각 서열의 끝에 도달한다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X 는 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(누클레오티드 서열에 관한)은 단어길이(W) 11, 예측값(E) 또는 10, M=5, N=-4 및 양쪽 나선의 비교값을 디폴트값으로 이용한다. 아미노산 서열에서, BLASTP 프로그램은 단어길이 3, 예측값(E) 10, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 정렬(B) 50, 예측값(E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 나선의 비교값을 디폴트값으로 이용한다. BLAST 알고리즘은 또한 두개의 서열간 유사성에 대한 통계적 분석도 행한다(예, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 참조). BLAST 알고리즘에 의한 유사성 측정의 한가지 방법은 두개의 누클레오티드 또는 아미노산 서열이 부합될 때마다 그 확률을 표시하는 것이다. 예를 들어, 피시험 핵산을 기준 핵산과 비교할 때 최소의 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우 상기 핵산은 기준 서열과 유사하다고 판단한다.