보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 합성 document_id A220623050835

표적 핵산 서열 또는 단백질과의 특정 결합을 기초로 하여, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 치료제로 사용하는 것은 광범위하게 연구되어 왔다. 구조적으로 변형된 올리고뉴클레오티드 유사체는 천연(포스포디에스터-연결) 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 감수성이 결여되도록 설계되고, 어떤 경우에는 표적으로의 결합 향상 또는 향상된 결합 특이성과 같은 다른 이점을 보이도록 설계되었다. 올리고뉴클레오티드 유사체의 이런 종류의 하나는 N3'→P5' 포스포로디아미데이트-연결 올리고뉴클레오티드이다(Gryaznov 및 Chen, 1994; Chen et al., 1994). 이들 화합물은 뉴클레아제 저항성이 있으며, 상보적 RNA 및 듀플렉스 DNA 표적과 안정한 듀플렉스를 형성하고, 생체 내 및 생체 외에서 상당한 서열-특이적 안티센스 활성을 증명하였다(Gryaznov et al., 1995; Escude et al., 1996; Gryaznov et al., 1996; Giovannangeli et al., 1997; Skorski et al., 1997). 관련 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 N3'→P5' 포스포라미데이트의 높은 RNA 결합 친화도를 유지하고, 또한 개선된 산 안정성을 보여준다(Pongracz 및 Gryaznov, 1999; Gryaznov et al., 2001). 어떤 N3'→P5' 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드는 치료학적으로 유망한 텔로머라제 저해 활성을 나타냈다(Gryaznov et al., 2003; Asai et al., 2003; Wang et al., 2004). 단계적으로, N3'→P5' 포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레이티드의 서열 제어된 제조는 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체를 사용하는데, 3'-아미노기는 첨가 중에는 보호되고, 다음에 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬 에 추가 단량체의 첨가를 위해 탈보호된다(예를 들면 Gryaznov 및 Chen, 1994; Pongracz 및 Gryaznov, 1999 참조). 합성 중에 전형적으로 보호되어 있는 뉴클레오시드 염기상의 기는 일차 아미노기이기 때문에, 이들 기가 존재하는 데에서 3'-아미노기의 보호에 대한 필요는 이들 단량체의 제조를 복잡하게 만들었다. 기존 과정(예를 들면 Nelson et al., 1997 참조)은 보호를 위한 복수 단계를 수반하여, 3'-히드록실의 3'-아지도(-N3)기로의 전환을 일반적으로 포함하며, 이것은 나중에 3'-아민으로 환원된다. 이들 과정은 시간 소비적이고, 고비용이며, 그리고 단량체의 낮은 수율을 발생시킨다. 따라서 이들 합성에 대한 효율 개선이 요구되며, 이는 N3'→P5' 포스포라미데이트 또는 티오포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드 제조를 용이하게 할 것이다. 발명의 개요 한 관점에서 본 발명은 보호된 뉴클레오시드 염기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 아데노신, 구아노신 또는 시토신 단량체의 제조 방법을 제공하며, 여기서 염기 및 3'-아미노기는 직교 보호된다. 한 구체예에서, 방법은 하기의 단계를 포함한다. (a) 5'-히드록실 기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'-아미노기가 비보호되어 있는 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시토신, 또는 구아노신 단량체를 제공하는 단계; (b) 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키고; 5'-히드록실기를 제 2 보호기와 반응시키고; 그리고 뉴클레오시드 염기를 제 3 보호기와 반응시키는 단계이며; 여기서 제 1 보호기는 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 3'-아미노기로부터 제거될 수 있으며, 제 2 보호기는 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기로부터 제거될 수 있다. 방법은 더 나아가 제 2 보호기를 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 5'-히드록실기로부터 제거하는 (c) 단계를 포함할 수 있다. 제 1 보호기는 산에 불안정한, 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸), 모노메톡시트리틸(MMT), 또는 디메톡시트리틸(DMT)과 같은 트리아릴메틸기일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 1 보호기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 또는 이것의 유도체이며, 이것은 DBU 또는 피페리딘 같은 염기성 아민으로 제거될 수 있다. 한 구체예에서, 아데노신 또는 시토신 단량체를 위하여 사용되는 바람직한 제 2 및 제 3 보호기는 둘 다 예를 들면 벤조일기와 같은 아실기이며, (c)의 조건은 히드록사이드 이온으로의 온화한 처리를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 2 보호기는 염기에 불안정한 예를 들면 트리메틸실릴(TMS) 에테르와 같은 트리알킬 실릴 에테르이며,제 3 보호기는 아실기이고, 그리고 (c)의 조건은 히드록사이드 이온으로의 온화한 처리를 포함한다. 다른 구체예에서, 제 2 보호기는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르이고, 제 3 보호기는 아실기이며, 그리고 (c)의 조건은 플루오라이드 이온으로의 처리를 포함한다. 이러한 플로라이드에 불안정한 실릴 에테르는 예를 들면 tert-부틸디메틸 실릴 에테르, tert-부틸디페닐 실릴 에테르, 디페닐메틸 실릴 에테르, 및 트리(이소프로필) 실릴 에테르를 포함한다. 한 구체예에서, 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르는 tert-부틸디메틸 실릴(TBDMS) 에테르이다. 대안적 구체예에서, 방법은 하기의 단계를 포함한다. (a) 5'-히드록실기, 뉴클레오시드 염기, 및 3'아미노기가 비보호 되어있는 3'-아미노-3'-데옥시 아데노신, 시토신, 또는 구아노신 단량체를 제공하는 단계; (b) 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키고; 뉴클레오시드 염기를 또 다른 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계이며; 여기서 제 1 보호기는 뉴클레오시드 염기가 탈보호되지 않는 조건 하에서 3'-아미노기로부터 제거될 수 있다. 방법의 이 구체예에서, 5'-OH기는 뉴클레오시드 염기의 보호 조건하에서 실질적으로 미반응으로 남아있으며, 별도의 보호를 요구하지 않는다. 한 구체예에서, 단량체는 시토신 단량체이고, 제 1 보호기는 상술한 바와 같으며, 그리고 다른 보호기는 아실기로서, 바람직하게는 벤조일기이다. 아실 보호기는 바람직하게는 무수 아실과의 반응에 의하여 형성된다. 다른 구체예에서, 단량체는 구아노신 또는 아데노신 단량체이고, 제 1 보호기는 상술한 바와 같으며, 그리고 또 다른 보호기는 디알킬포름아미디닐기와 같은 포름아미디닐기이다. 관련된 측면에서, 본 발명은 자유 5'-히드록실기 및 보호된 3'-아미노기를 갖는 티미딘 단량체의 제조 방법을 제공하는데, 방법은 하기를 포함한다. (a) 5'-히드록실기 및 3'-아미노기가 비보호 되어있는 3'-아미노-3'-데옥시 티미딘 단량체를 제공하는 단계; 및 (b) 3'-아미노기를 제 1 보호기와 선택적으로 반응시키는 단계. 제 1 보호기는 산에 불안정할 수 있는데; 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸)과 같은 트리아릴메틸기이다. 또 다른 구체예에서, 제 1 보호기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 또는 이것의 유도체로서, DBU 또는 피페리딘과 같은 염기성 아민으로 제거될 수 있다. 이 합성 방법에서 시작 및 생성 단량체는 바람직하게는 수소, 히드록시, 저급 알콕시, 저급 알킬, 및 플루오로로부터 선택되는 2'기를 포함한다. 선택된 구체예에서, 단량체는 수소, 히드록시, 메톡시, 및 플루오로로부터 선택된 2'기를 포함한다. 한 구체예에서, 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 2'기가 수소이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 보호된 3'-아미노기, 및 (i) 비보호 되거나, 또는 (ii) 뉴클레오시드 염기를 탈보호하지 않는 조건하에서 보호된 3'-아미노기가 탈보호될 수 있도록 보호된 뉴클레오시드 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 아데노신, 구아노신 또는 시토신 단량체를 제공한다. 선택된 구체예에서, 3'-아미노기는 산에 불안정한 보호기로 보호되는데, 예를 들면 트리페닐메틸(트리틸)과 같은 트리아릴메틸기이다. 다른 구체예에서, 3'-아미노기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 또는 이것의 유도체이며, DBU 또는 피페리딘과 같은 염기성 아민으로 제거될 수 있다. 한 구체예에서, 뉴클레오시드 염기는 비보호되어 있으며; 다른 구체예에서는, 뉴클레오시드 염기는 아실기로 보호되어 있다. 바람직하게는, 아실기는 단량체가 아데노신 또는 시토신 단량체일 때 벤조일이 되고, 단량체가 구아노신 단량체일 때는 이소부티릴이다. 또 다른 구체예에서, 뉴클레오시드 염기는 포름아미디닐기로 보호되며, 바람직하게는 뉴클레오시드 염기는 디알킬포름아미디닐기로 보호된다. 단량체의 5'-히드록실기는 비보호 되거나, 또는 뉴클레오시드 염기 또는 3'-아미노기를 탈보호하지 않는 조건 하에서 탈보호될 수 있도록 보호될 수 있다. 예를 들면, 상술한 바와 같이 온화한 염기 또는 플루오라이드에 불안정한 실릴 에테르로 보호될 수 있다. 단량체는 바람직하게는 수소, 히드록시, 저급 알콕시, 저급 알킬, 및 플루오로로부터 선택된 2'기를 포함한다. 선택된 구체예에서, 단량체는 수소, 히드록시, 메톡시, 및 플루오로로부터 선택된 2'기를 포함한다. 한 구체예에서, 단량체는 2',3'-디데옥시 단량체로서, 2'기가 수소이다. 본 발명의 이들 및 다른 목적과 특징은 하기 본 발명의 상세한 설명을, 첨부된 도면과 함께 읽을 때에 보다 충분히 명확해질 것이다.