로소니아 인트라셀룰라리스 진단 방법 document_id A220623050844

돼지 증식성 장염("PPE")의 병원체인 엘. 인트라셀룰라리스는 실질적으로, 사람, 토끼, 흰담비, 햄스터, 여우, 말, 및 타조 및 에뮤와 같이 다양한 기타 동물을 포함하는 모든 동물에 감염된다. 엘. 인트라셀룰라리스는 특히 미국 뿐만 아니라 유럽에서 돼지 무리를 상당히 감소시키는 원인이다. PPE의 고유 특징은 장 감염 부위에서 굽은 형태의 바실리(bacilli)가 막과 결합되지 않은 상태로 장 세포의 세포질내에 존재한다는 것이다. PPE와 관련된 세균은 "캄필로박터(Campylobacter)형 유기체"로서 언급되었다[문헌참조: S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1989)]. 이어서, 당해 발병 세균은 분류학적으로 신규한 속 및 종으로서 동정되었고 속칭으로 회장 공생자(IS) 인트라셀룰라리스로서 언급되었다[문헌참조: C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1993)]. 보다 최근에, 이들 신규 세균은 로소니아(L) 인트라셀룰라리스라는 분류명이 주어졌다[문헌참조: S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995)]. 이들 3개의 명칭은 본원에서 추가로 동정되고 기재된 것과 동일한 유기체를 언급하는데 혼용되었다. 엘. 인트라셀룰라리스는 통상적인 무세포 배지상에서 일반적인 세균학적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대 세포내 세균이고 상피 세포에 부착하여 증식하는 것으로 사료되었다. 문헌[참조: S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61 , No. 19, 4286-4292 (1993) 및 G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31 , No. 5, 1136-1142 (1993)]은 통상적인 조직 배양 플라스크에서 IEC-18 랫트 장 상피 세포 단층을 사용한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양법을 논의하였다. 추가로, 문헌[참조: H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-3236 (1991)]은 통상적인 조직 배양 플라스크에서 장 407 사람 배아 장 세포 단층 및 GPC-16 기니아 피그 결장 선암종 세포 단층을 사용하는 방법을 논의하였다. 특히, 엘. 인트라셀룰라리스는 바람직하게 미국 특허 제5,714,375호 및 제5,885,823호에 따라 당업계에 공지된 방법으로 배양할 수 있다. 예를 들어, 배양 세포는 먼저 엘. 인트라셀룰라리스 세균을 포함하는 접종물로 접종하여 당해 세포를 세균으로 감염시킬 수 있다. 본 발명을 수행하는데 있어서, IEC-18(ATCC 1589)-랫트 장 상피 세포, HEp-2(ATCC 23)-사람 상피형 암종 세포, McCoys(ATCC 1696)-마우스(비 특이적) 세포, BGMK(Biowhittaker #71-176)-버팔로 그린 원숭이 신장 세포 및 돼지 장 상피 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 세포주를 사용할 수 있다. 배양 세포가 사용되는 경우, 접종전에 당해 세포는 단층 형태일 수 있다. 단층을 형성하기 위해, 당해 세포는 통상적인 플라스크에 종자로서 주입될 수 있다. 각각의 플라스크는 일반적으로 성장 배지와 혼합된 25, 75, 150, 850cm2의 플라스크 또는 롤러 병당 약 1 x 105개의 세포 내지 약 10 x 105개의 세포가 씨딩된다. 증식 배지는 질소원, 선택 배양 세포용 필수 성장 인자 및 글루코스 또는 락토스와 같은 탄소원을 포함하는 세포 배양용 임의의 배지일 수 있다. 바람직한 배지는 1 내지 5%의 태아 소 혈청 함유 햄스 F 12가 보강된 DMEM이지만 기타 시판되는 배지가 양호하게 사용될 수 있다. 엘. 인트라셀룰라리스는 배양 세포를 일정한 증식 상태로 유지시킴으로써 보다 성공적으로 배양이 증진된다. 따라서, 배양 세포 단층은 접종 시점에 컨플루언시(confluency)가 약 20% 내지 약 50%이어야만 한다. 바람직하게, 세포는 접종 시점에 컨플루언시가 약 30% 내지 약 40%이어야만 하고 가장 바람직하게는 컨플루언시가 약 30%이어야만 한다. 또한, 접종하기 전에, 세포는 하기에 기재된 바와 같이 현탁 상태로 증식될 수 있다. 바람직하게, 세포는 먼저 접착형 시스템, 예를 들어, 롤러 병 시스템에서 단층 형태로 컨플루언시가 100%가 될때까지 증식시키고 3 내지 3000 리터로 이동시켜 현탁 상태로 증식시킨다. 접종물은 감염된 돼지 또는 기타 동물로부터 수득한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양물일 수 있다. 접종물은 PPE로 감염된 돼지 또는 기타 동물의 회장으로부터 점막을 긁어내어 제조된 장 파쇄물일 수 있다. 장 파쇄물을 제조하는 경우, 배양용으로 선택된 회장 부분은 장 전체가 두터워진 중증 병변부를 나타내어야만 한다. 세균이 본래 약체이기때문에, 당해 샘플은 바람직하게 검시 후 가능한한 신속하게 -70℃에서 저장되어야만 한다. 엘. 인트라셀룰라리스가 내성인 항생제, 예를 들어, 약소하게 거론하자면, 반코마이신, 앰포테리신 B 또는 젠타마이신 및 네오마이신을 포함하는 아미노글리코사이드 그룹 항생제의 구성원을 바람직하게 접종물에 첨가하여 오염 세균을 억제시키면서 엘. 인트라셀룰라리스를 증식시킨다. 접종물이 순수한 배양물 또는 장 파쇄물이든 상관없이 배양 세포의 접종은 본원에 교시된 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 이어서 감소된 O2 용존 농도하에 세균 및/또는 접종 배양 세포를 배양한다. 10% 초과의 용존 산소 농도에서, 엘. 인트라셀룰라리스 증식은 최적 이하이고 궁극적으로 당해 범위를 벗어나는 산소 농도에서 결국 증식이 정지된다. 바람직하게, 세균 및/또는 접종 배양 세포는 약 0% 내지 약 10% 범위의 용존 산소 농도에서 배양한다. 보다 바람직하게, 세균 및/또는 세포는 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 배양하고 약 0% 내지 약 3.0%의 산소 농도가 가장 바람직하다. 적당한 이산화탄소의 농도는 또한 엘. 인트라셀룰라리스의 적절한 증식에 중요하다. 0% 초과 내지 4% 미만의 이산화탄소 농도에서, 비최적으로 증식하게되고 당해 범위를 벗어나는 이산화탄소 농도에서 결국 증식은 정지된다. 바람직하게, 이산화탄소 농도는 약 6% 내지 약 10% 범위이고 약 8.8%의 이산화탄소 농도가 가장 바람직하다. 추가로, 당해 세포는 바람직하게 약 73% 내지 약 96%의 수소 농도 범위에서 배양한다. 질소는 존재하는 수소의 일부 또는 전부를 대신하여 사용될 수 있다. 가장 바람직하게, 당해 세포는 약 0 내지 약 8.0%의 O2, 약 8.8%의 CO2 및 약 83.2%의 H2에서 배양한다. 접종 세포는 적당한 수소, 산소 및 이산화탄소 농도를 함유하고 세포를 배양동안에 현탁시키는 이원 가스 배양기 또는 기타 가스 챔버에서 배양할 수 있다. 챔버는 배양된 세포의 현탁을 유지시키는 수단 및 가스 모니터, 및 적당한 가스 농도를 공급하고 유지시키는 공급원을 포함해야만 한다. 배양 온도는 30℃ 내지 약 45℃ 범위이어야만 하고 보다 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 38℃ 범위이어야만 한다. 가장 바람직하게, 당해 온도는 약 37℃이다. 배양 및 약독화를 위한 필수 장비는 본원에 교시된 바와 같이 당업자가 용이하게 구입할 수 있다. 본 발명을 수행하는데 적합한 장비의 한 예는 현탁 상태로 세포를 유지시키는 스피너 플라스크와 연계된 이원 가스 배양기, 예를 들어, 모델 480(Lab-Line, Melrose Park, IL)이다. 현재 바람직한 장비는, 배지를 함유하고, 적당한 농도의 가스를 내뿜거나 기계적 교반 수단으로 세포를 현탁된 상태로 유지하고 배지내 용존 O2 수준을 계속 모니터링할 수 있는 발효기, 생물반응기, 교반 플레이트 또는 회전 진탕기를 포함한다. 제조원(New Brunswick, Braun) 및 기타 회사에서 상기 목적을 위해 적합한 발효기 및 생물반응기를 제조하였다. 접종 세포를 배양동안에 현탁된 상태로 유지시킴으로써 각각의 개별 세포는 증식 배지 및 수소, 산소 및 이산화탄소의 적당한 혼합물에 대한 노출이 증가되어 세포 및 이에 따른 엘. 인트라셀룰라리스는 최대로 증식된다. 배양 세포는 예를 들어, 배양 플라스크, 롤러 병, 막 배양, 바이오백, WAVETM 생물반응기 시스템 및 스피너 플라스크를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 교반시켜 현탁상태로 유지시킬 수 있다. 당해 세포는 배양 동안에 세포를 이원 가스 배양기 또는 유사한 장치 내부에 스피너 플라스크중에서 배양하여 현탁 상태로 유지될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "스피너 플라스크"는 패들, 프로펠러 또는 배양물을 교반시키고 거기에 포함된 세포를 현탁 상태로 유지시키는 기타 장치를 의미한다. 또한, 접종 세포는 세포가 컨플루언시에 도달할때까지 배양하고 이어서 세포를 증식 배지를 함유하는 스피너 플라스크에 위치시키고 플라스크를 회전시키면서 이원 가스 배양기에서 배양한다. 바람직하게, 접종 세포는 긁어내거나 트립신 처리하여 스피너 플라스크에 계대시킨다. 이것은 세포를 탈리시키기 위해 세포 스크래퍼를 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 일단 세포가 스피너 플라스크에 도입된 후, 스피너 플라스크의 패들을 통상적으로 자기 교반 플레이트상에서 약 30 내지 약 60rpm 범위로 회전시켜 감염된 세포를 현탁 상태로 유지시킨다. 이어서, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 새로운 배양물에 계대시켜 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 생산을 증가시킨다. 용어 "계대" 또는 이에 대한 본원의 또 다른 용어는 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 새로운 세포 배양물로 이전시켜 새로운 세포를 세균으로 감염시키는 과정을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "새로운"은 엘. 인트라셀룰라리스에 의해 아직 감염되지 않은 세포를 의미한다. 바람직하게, 당해 세포는 평균적으로 약 하루가 지나지 않은 세포이다. 현탁 배양물에서 엘. 인트라셀룰라리스는 원 배양물 일부를 제거하고 이를 새로운 배양 세포를 함유하는 신규 플라스크에 첨가하여 계대시킬 수 있다. 원 배양물이 ml당 매우 많은 세균을 갖는 경우, 예를 들어, 약 104 세균/ml을 초과하는 경우, 배양물 약 1 내지 10%(용적 대 용적)을 감염된 플라스크로부터 새로운 세포를 함유하는 신규 플라스크로 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 바람직하게, 세포 50 내지 100%가 감염된 경우 수행된다. 세포 50% 미만이 감염된 경우, 배양물을 절반(1:2)으로 신규 플라스크로 분할하고 새로운 배지를 첨가하여 용적을 스케일-업함에 의해 계대한다. 어느 경우이건, 선행 기술에서와 같은 단층 배양물의 계대와 직접 비교하여 세포 용해 및 기타 단계는 요구되지 않는다. 간접 형광 항체(IFA) 염색, TCID50 또는 기타 상응하는 방법에 의해 측정된 바와 같이, 배양 세포의 충분한 증식 및 이에 따른 엘. 인트라셀룰라리스에 의한 감염 후, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 세균의 적어도 일부를 수거한다. 수거 단계는 본원에 교시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 세균을 현탁액으로부터 분리함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게, 엘. 인트라셀룰라리스 세균은 현탁물의 일부 또는 전부를 원심분리하여 배양 세포를 펠렛화하고 수득한 세포 펠렛을 재현탁시키고 감염된 세포를 용해시킴에 의해 수거된다. 전형적으로, 당해 내용물중 적어도 일부를 약 3000xg에서 약 20분동안 원심분리하여 세포 및 세균을 펠렛화한다. 이어서 당해 펠렛을 예를 들어, 슈크로스-포스페이트-글루타메이트(SPG) 용액중에 재현탁시키고 25게이지 바늘을 통해 약 20회 통과시켜 당해 세포를 용해시킬 수 있다. 추가의 정제가 요구되는 경우, 샘플을 약 145xg에서 약 5분동안 원심분리하여 세포 핵 및 잔해물을 제거한다. 이어서 상등액을 약 20분동안 약 3000xg에서 원심분리하고 수득한 펠렛을, 태아 소 혈청이 함유된 SPG와 같은 적절한 희석제에 현탁시키거나(동결건조, 동결 또는 접종물로서 사용하기에 적합한 세포를 수거하기 위함) 또는 증식 배지에 현탁시킨다(새로운 세포에 계대시키기에 보다 적합한 세균을 수거하기 위함). 이전에 언급된 바와 같이, 대량 생산을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 효과적인 증식은 조직 세포를 활발한 증식 상태로 유지시킴에 의해 증진된다. 현탁 배양물의 사용은 세포의 활발한 증식 유지를 상당히 용이하게하고 연속 배양 확대 및 스케일 업을 가능하게 한다. 상기에서 설명된 바와 같이 용존 O2가 약 0 내지 3%인 발효기를 사용하여 108 세균/ml까지 증식시킬 수 있다. McCoys 또는 IEC-18 세포를 사용하는 경우, 증식 배지와 함께 컬티스피어-G 다공성 마이크로캐리어(HyClone Laboratories, Logan Utah)와 같은 젤라틴, 아가로스, 콜라겐, 아크릴아미드 또는 실리카 비드를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, HEp-2 세포 및 기타 세포는 본원에 사용된 방법에 따른 마이크로캐리어를 요구하지 않는다. HEp-2를 배양하면서 세포 유지 목적으로, 바람직하게 당해 배양물 25% 내지 50%를 제거하고 주 간격으로 새로운 배지로 대체한다. 마이크로캐리어 또는 비드를 사용한 세포 배양을 위해, 바람직하게 배양물 25% 내지 50%를 제거하고 주간 1 또는 2회 새로운 배지로 대체한다. 스케일 업하기 위해, 배지 또는 마이크로캐리어를 함유한 배지의 25% 내지 50%가 당해 배양물에 추가로 첨가될 수 있다. 배양 세포가 감염되는 비율에 따라, 새로운 세포로의 계대는 일반적으로 약 2일 내지 약 7일 마다 수행한다. 배양 세포가 2 내지 7일내에 70% 이상 감염된다고 가정할때, 바람직하게 계대는 약 5 내지 7일마다 수행한다. 현재 엘. 인트라셀룰라리스 항원의 진단은 직접 면역형광 및 PCR에 의해 수행되고 있다. 현재 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 항체의 진단은 면역 형광을 사용하여 수행된다. 이들 방법은 힘이 들고 시간 소모적이며 대규모 스크리닝을 위해서는 적합하지 않다. PPE의 효과적인 진단은 또한 발병 세균을 배양하는데 요구되는 시간 때문에 방해된다. 본 발명의 결과로서, PPE에 민감한 돼지 및 기타 동물로부터 채취한 생물학적 샘플내에서 엘. 인트라셀룰라리스의 존재 여부에 대한 신속하고 정확한 분석을 촉진하는 진단 도구의 개발이 현재 가능하다. 따라서, 본 발명의 바탕이 되는 기술적 문제는 엘. 인트라셀룰라리스 질환의 진단을 위한 방법을 개선시키는 것이다. 발명의 개요 본 발명은 동물 보건 분야 및 특히 로소니아 인트라셀룰라리스에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 및 로소니아 인트라셀룰라리스 특이적 항체를 사용하는 진단 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 방법 또는 시험 키트의 용도에 관한 것이다.