프로브 복합체 document_id A220623050856

면역조직화학법이나 면역측정법은 항원과 항체의 면역반응을 이용하여 생체내의 자기 항원 또는 외래 항원을 검출하는 방법으로 이용되고 있다. 이들 방법은 특이성과 감도가 높기 때문에 생체내에 존재하는 미량의 물질을 분리함없이 검출할 수 있다. 면역조직화학법은 항원과 항체의 특이적인 반응을 이용하여 목적으로 하는 항원의 세포 내의 국재(localization) 또는 조직내에서의 국재를 검출하는 수법이다. 일반적으로 널리 사용되고 있는 ABC법에 의한 면역조직화학법은 다음과 같은 공정으로 실시한다. 동결조직이나 파라핀 고정된 조직으로부터 조직 절편을 제조한다. 이어 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 소 혈청 알부민 등으로 블록킹을 실시한다. 여기에 목적하는 항원에 결합되는 항체와 비오틴을 결합시킨 비오틴화 항체를 반응시켜 항원과 비오틴화 항체의 면역결합체가 형성된다. 이 면역복합체에 서양꽃양배추 퍼옥시다제(HRP) 등의 효소가 결합된 애비딘을 첨가하여 비오틴-애비딘 효소 복합체를 형성시켜 효소의 발색기질이나 발광 기질에 의해 목적으로 하는 항원을 검출한다. 애비딘에 플루오레세인 등의 형광물질이나 아크리디늄 에스테르 등의 발광물질을 도입하여 목적하는 항원을 검출할 수 있다. 또한 혈청 등의 생체 시료 중의 항원을 검출하는 면역측정법은 다음과 같은 공정으로 실시한다. 먼저 마이크로플레이트 등의 담체에, 측정할 항원과 결합할 포착 항체를 고상화한다. 그후 항체나 담체에 비특이적인 흡착을 방지하기 위하여 소 혈청 알부민 등으로 블로킹을 실시한다. 여기에 측정할 항원이 포함되는 시료를 가하고 포착 항체와 목적으로 하는 항원을 결합시킨다. 또한 항원을 인식하는 항체 등의 프로브와 비오틴 등의 하프텐이 결합된 프로브 복합체를 첨가하고, 포착된 항원과 프로브 복합체를 결합시킨다. 이것에 의해 포착 항체-항원-프로브 복합체의 면역 복합체가 마이크로플레이트 등의 담체 상에 형성된다. 이 면역복합체의 비오틴과 HRP 표식 애비딘을 결합시켜 HRP의 발색 기질이나 발광 기질을 가하여 목적으로 하는 항원을 측정한다. 상기와 같은 면역조직화학법이나 면역측정법으로는 항체 등의 프로브와 비오틴이 결합된 프로브 복합체가 사용되고 있다. (예컨대 비특허문헌 1 참조) 이 비오틴 대신 디니트로페닐 (DNP), 디곡시게닌(DIG), FITC 등의 하프텐을 항체와 결합시켜 프로브 복합체로 하고 이들 하프텐을 인식하는 항체에 효소를 결합시켜 검출하는 방법도 개발되어 있다. 효소를 사용하지 않고 비오틴 대신 플루오레세인 등의 형광 기질이나 아크리디늄 에스테르 등의 발광 기질과 항체를 결합시켜 프로브 복합체로 하고 형광이나 발광에 의해 검출하는 면역측정법도 개발되어 있다. 이들 면역조직화학법이나 면역측정법은 감도와 특이성이 높은 검출법이지만 생체내에는 통상의 방법으로는 검출하는 것이 곤란한 미량물질도 다수 존재한다. 예컨대 인간 가스트린 방출 펩티드 전구체(proGRP)의 정상인의 혈청 농도는 14 pg/ml 정도이고, 암태아성 항원(CEA)이나 α-페토프로테인의 정상인 혈청중 농도인 5~20 ng/ml와 비교하면 1000배 정도의 감도가 필요하다. 또한 외래항원인 C형 간염 바이러스(HCV)는 혈중에 존재하는 바이러스 양이 매우 적기 때문에 100-1000 카피의 바이러스 RNA를 검출하는 감도가 필요하며 단백질의 농도로는 약 0.03 내지 0.3 pg/ml의 항원을 검출하는 감도가 필요하다. 생체내의 미량 물질을 검출하기 위하여 면역조직화학법이나 면역측정법의 감도를 상승시키기 위한 개량이 행하여져 오고 있다. 면역조직화학법이나 면역측정법의 감도 상승을 위해서는 다양한 요소가 관여되어 있으나 상기 항원과 결합하는 항체 등의 프로브와 비오틴 등이 결합된 프로브 복합체의 기능을 개량하는 것도 1개의 요소이다. 예컨대 1분자의 항체에 결합시키는 비오틴의 분자수를 증가시키는 것에 의해 그 비오틴에 결합되는 애비딘, 애비딘에 결합된 효소 등의 분자수가 증가되어 발색이나 발광 시그널이 상승하여 감도가 상승한다. 그러나 종래의 항체 등의 프로브와 비오틴이나 하프텐 등이 결합된 프로브 복합체는 항체에 직접 하프텐을 결합시키는 것이다. 예컨대 항체에 비오틴을 결합시키는 1개의 방법은 항체의 아미노기와 비오틴에 도입된 NHS 에스테르를 반응시켜 공유결합에 의해 제작하는 것이다. 이 경우 반응 조건의 검토에 의해 1분자의 항체에 결합되는 비오틴의 분자수를 증가시킬 수 있다. 그러나 항체의 아미노기의 수는 제한되어 있고 결합되는 비오틴의 분자수도 한계가 있다. 또한 항체의 항원결정기근방의 아미노기에 비오틴이 결합된 경우는 역으로 입체장애 등에 의해 항체와 항원의 결합을 저해하는 것도 고려할 수 있다. 또한 결합시키는 하프텐이 소수성 물질인 경우는 항체에 다수의 소수성 하프텐이 결합되면 프로브 복합체 전체로서의 소수성이 강해진다. 면역조직화학법이나 면역측정법에서 프로브 복합체의 소수성이 강하면 조직이나 플레이트으로의 소수 결합에 의한 비특이적 결합이 생겨 백라이트의 상승에 관련되어 충분한 감도를 얻을 수 없게 된다. 비특허문헌1: Harlow, E. 및 Lane, D. 저 "Antibodies: A LABORATORY MANUAL" (미국), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988년, p.340-341.