재조합 미생물을 이용한 플라보노이드 생산 document_id A220623051029

플라보노이드(flavonoid)는 다양한 계열의 식물 폴리페놀 물질이다. 플라보노이드 분자의 기본 구조는 A 고리, B 고리 및 C 고리로 불리는 3개의 페놀 고리로 이루어진다(도 1). 플라보노이드는 페닐알라닌과 아세트산으로부터 합성된 복합 대사산물에서 유래되는 것이다. 이 화합물에는 대부분의 고등 식물에서 발견되는 몇몇 주요 서브그룹, 예컨대 찰콘, 플라바논, 플라본, 플로보놀, 플라반-3-올, 플라반-4-올, 디하이드로플라보놀, 안토시아닌, 프로안토시아니딘 및 축합형 탄닌이 있다. 플라보노이드는 식물과 미생물 간의 시그널 전달에서, 일부 종의 웅성 번식력에서, 항미생물제로서 방어에서, 그리고 UV 보호에서 주요 역할을 한다(Winkel-Shirley, 2001, Plant Physiol., 126(2): 485-493). 플라보노이드의 일반적인 생합성 경로는 도 1에 제시한 바와 같다. 플라바논(flavanone)은 매우 다양한 플라보노이드의 공통 전구체이다. 이의 항산화성 및 다양한 사람 병리 상태에 대한 건강 상의 효용이 입증되어, 이러한 일반적인 분야에서 상당한 연구 관심의 대상이 되었다. 플라본(flavone)은 복소환식 피론(pyrone)을 통해 연결된 2개의 벤젠 고리로 이루어진다(Middleton et al., Pharmacol.Rev. 52: 673-751, 2000). 크리신(chrysin), 아피제닌(apigenin) 및 루테올린(luteolin)과 같은 플라본은 다양한 약리학적 특성, 예컨대 항불안 효과(Viola et al., 1995, Planta Med., 61: 213-216; Wolfman et al., Pharmacol. Biochem. 47: 1-4, 1994; Wolfman et al., 1995, J.Neurochem. 65:S167), 허혈 후 심장 기능 향상(Lebeau, 2001. Bioorg.Med.Chem.Lett. 11:23-27; Rump et al., 1994, Gen.Pharmacol. 25:1137-1142; Schussler et al., 1995, Gen. Pharmacol. 26: 1565-1570) 및 유방 암세포 배양물에서의 항에스트로겐 효과(Miksicek, 1995. P.Soc.Exp.Biol.Med. 208: 44-50) 등을 나타낸다. 플라본은 파슬리, 백리향, 셀러리 및 붉은 피망(sweet red pepper) 등을 비롯한 비교적 작은 식품 그룹에서만 나타난다(Ross et al., 2002, Annu.Rev.Nutr. 22: 19-34). 플라본과 플라바논의 생합성은 P450 모노옥시게나제인 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)에 의한 신남산의 p-쿠마르산으로의 전환에서부터 시작한다. 그 다음, p-쿠마르산은 4-쿠마로일:CoA 리가제(4CL)에 의해 4-쿠마로일-CoA로 전환된다. 그 다음, 찰콘 신타제(CHS)가 4-쿠마로일-CoA와 말로닐-CoA 3 분자의 축합 반응을 촉매하여 테트라하이드록시찰콘을 형성한다. 이 반응 다음, 찰콘 이소머라제(CHI)는 하류에 있는 많은 중요한 플라보노이드(예, 플라본)의 분지점 전구체인 (2S)-플라바논으로의 테트라하이드록시찰콘의 입체특이적 이성질화 반응을 수행한다. 대부분의 경우에, (2S)-플라바논으로부터 플라본의 생합성은 막에 결합된 시토크롬 P450-모노옥시게나제인 플라본 신타제 II(FSII)가 촉매한다. 하지만, 아피시에(Apiciae)의 특정 종에서는 이 반응이 가용성 플라본 신타제 I(FSI)에 의해 수행되기도 한다(도 1)(Lukacin et al., 2001, Arch.Biochem.Biophys. 393: 177-83; Martens et al., 2001, Phytochemistry 58: 43-46). 모든 플라보노이드 분자 중에서, 플라보놀은 가장 오래되고 널리 분포된 것으로 간주되고 있다(Stafford, 1991). 최근에, 플라보놀의 항산화 활성은 산화 스트레스 관련 만성 질환의 예방 가능성으로 인해 많은 관심을 받고 있다. 이와 관련하여, 아폽토시스 유도, 항돌연변이유발, 히스타민 방출 억제 및 혈관형성 억제와 같은 분야에서 플라보놀의 다양한 생물학적 효과에 대한 많은 연구가 소개되었다(Formica, et al., 1995; Lambert, et al., 2005; Lamson, et al., 2000). 플라보놀의 생합성에서, (2S)-플라바논은 전술한 바와 같이 형성된다. 이후, 플라바논 3β-하이드록실라제(FHT)의 작용에 의해 (2S)-플라바논으로부터 천연 (2R,3R)-트랜스-디하이드로플라보놀이 형성된다. 마지막으로, 플라보놀 신타제(FLS)인 2-옥소글루타레이트 의존 다이옥시게나제(dioxygenase)는 상기 디하이드로플라보놀의 플라보놀로의 불포화를 촉매한다. 식물의 천연 색소 중에서, 안토시아닌은 대부분의 과실, 꽃잎 및 잎에서 발견되는 가장 큰 수용성 그룹이다. 이 색소의 색은 연어살 핑크, 진홍색 및 자홍색에서부터 보라색, 자주색 및 청색에 이르기까지 다양하다. 이러한 도처에 존재하는 화합물이 이의 안정성과 색에 상당한 영향을 미치는 생리학적 조절 및 화학적 변형에 의해 좌우되는, 단순 형태에서부터 복잡한 형태에 이르기까지 많은 구조 형태로 존재할 수 있다는 점은 매우 흥미롭다. 안토시아닌은 꽃가루 매개자 및 종자 분산체의 모집 및 UV 보호와 같은 중요한 역할을 한다. 이러한 밝은 색의 안토시아닌이 실제 사용 분야에서 처음으로 관심의 대상이 된 원인은 안토시아닌이 사람 건강에 미치는 뚜렷한 부작용이 없는 바, 금지된 염료의 대체물로서의 가능성 때문이었다(Brouillard, 1982, Anthocyanins as Food Colors, Academic Press, Inc, New York, NY). 하지만, 최근에는 보편적인 항산화성(Kahkonen et al.k, 2003, J.Agric. Food Chem., 51: 628-633; Noda et al., 2000, Toxicology, 148: 119-123; Satue-Gracia et all., 1997, J.Agric.Food Chem., 145: 3362-3367) 및 과실과 채소가 풍부한 음식물 소비와 암 및 심혈관 질환을 비롯한 만성 질환의 위험률 저하 간의 일관된 관련성(Hannum, 2004, Crit.Rev.Food Sci.Nutr., 44: 1-17; Middleton et al., 2000, PHarmocholo. Rev., 52:673-751)으로 인해, 플라보노이드 유래 식물 제품(안토시아닌 포함)에 많은 관심이 집중되고 있다. 결과적으로, 안토시아닌은 특성이 잘 규명된 미생물 숙주, 예컨대 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)을 이용한 발효 생산의 매력적인 표적이 되고 있다. 안토시아니딘(안토시아닌의 아글리콘 형태)의 주요 종류에는 6가지, 즉 펠아르고니딘(pelargonidin), 시아니딘(cyanidin), 델피니딘(delphinidin), 페오니딘(peonidin), 말비딘(malvidin) 및 페투니딘(petunidin)이 있다. 안토시아닌의 기본 구조는 2-페닐벤조피릴륨 염 또는 플라빌륨 염의 폴리하이드록시 유도체 및 폴리메톡시 유도체의 당화 형태이다. 안토시아닌의 생합성은 찰콘 → 플라바논 → 디하이드로플라보놀 → 안토시아니딘 → 안토시아닌 경로를 통해 진행된다(도 1). 플라바논은 전술한 바와 같이 합성된다. 그 다음, 이 플라바논으로부터 플라바논 3-하이드록실라제(FHT)의 작용에 의해 플라바논이 형성된다. 그 다음 단계에서, 디하이드로플라보놀 4-리덕타제(DFR)는 무색의 디하이드로플라보놀인, 디하이드로켐페롤(dihydrokaempferol; DHK), 디하이드로퀘르세틴(dihydroquercetin; DHQ) 또는 디하이드로미리세틴(dihydromyricetin; DHM)을 각각의 3,4-시스-류코안토시아니딘으로 NADPH 의존적 반응으로 환원시킨다. 이러한 DFR의 3가지 기질은 이 효소 반응에 적용되지 않는 β 페닐 고리 위의 추가 히드록실 기의 수만이 다를 뿐, 구조가 매우 유사하다. 지금까지 연구된 많은 식물 종(모든 종은 아니다) 유래의 DFR은 3가지 기질을 모두 이용할 수 있다. 무색의 불안정한 류코안토시아니딘은 생합성 경로의 최초 유색 대사산물인 안토시아니딘의 직접적인 전구체이다. 이러한 2-옥소글루타레이트 의존적 반응은 안토시아니딘 신타제(ANS)에 의해 촉매된다. 안토시아니딘은 불안정성 때문에 식물 조직에서는 거의 검출되지 않는다. 그 대신, 안토시아니딘 3-글루코사이드가, 식물에서 검출될 수 있는 이 경로의 최초 안정성 유색 대사산물로서, UDP-글루코스:플라보노이드 3-O-글루코실트랜스퍼라제(3-GT) 효소의 작용을 통해 안토시아니딘으로부터 유도된다. 현재, 각종 식물 종에서 안토시아닌 생합성 경로에 관여하는 많은 효소들의 cDNA 서열은 이용가능하다. 비식물계에서 플라보노이드를 합성하려는 시도가 이루어졌지만, 아직까지 만족스러운 시스템은 개발되지 못했다. 최근, 황(Hwang et al.)은 최초로 이 콜라이에서 페닐알라닌을 테트라하이드록시찰콘으로 전환시키는 이종 공급원 유래의 3가지 유전자를 발현시켜 식물 특이적 플라바논의 합성을 증명했다. 하지만, 최종 산물(플라바논)은 pH를, 테트라하이드록시찰콘이 천연 플라바논 (2S)-나린제닌 및 이의 비천연 변종 에피머인 (2R)-나린제닌으로 자발적으로 전환되어지는, pH 9로 상승시켜 생산했다(Hwang et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 2699-2706). 또한, 안토시아닌에 대한 미생물 또는 효모 생산에 대해서는 지금까지 밝혀진 바가 없다. 이와 같이, 이종계에서 플라보노이드를 생산하는 시스템을 필요로 하는 현실과 다양한 식물 유래의 플라보노이드 생합성 경로에 관여하는 다수 효소들의 cDNA 서열의 규명에도 불구하고, 다양한 플라보노이드를 미생물계에서 합성하기 위한 적합한 시스템 및 방법은 아직까지 개발되지 않은 상태이다. 따라서, 증가되는 플라보노이드 화합물의 필요성을 화학적 전환의 필요 없이 만족시킬 수 있는 사용가능한 양의 플라보노이드를 생산할 수 있는 방법 및 시스템의 개발의 필요성은 여전히 계속되고 있다. 발명의 개요 본 발명은 미생물 숙주에서 플라보노이드를 생산하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이 방법은 유전자 세트를 이종 숙주 세포에 도입시키는 단계, 이 세포를 상기 유전자의 발현으로 효소를 유도하는 적합한 배지에서 증식시키는 단계를 포함한다. 이와 같이 형질전환된 세포에 특정 기질(들)이 제공되면, 효소가 기질에 작용하여 목적하는 플라보노이드가 생산된다. 일 양태에 따르면, 페닐프로파노이드의 일반적인 범주에 속하는 기질을 전환시켜 플라바논을 생산할 수 있는 효소를 암호화하는 유전자 세트가 제공된다. 다른 양태에 따르면, 플라바논을 다른 다양한 플라보노이드로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 유전자 세트가 제공된다. 이러한 플라보노이드에는 플라본, 플라반-3-올, 플라반-4-올, 플라보놀 및 안토시아닌, 및 이 화합물들의 합성 시의 중간체가 있다. 이러한 중간체에는 디하이드로플라보놀, 류코안토시아니딘 및 안토시아니딘이 있다. 다른 양태에 따르면, 페닐프로파노이드를 플라바논, 플라본, 플라보놀, 디하이드로플라보놀, 플라반-3-올, 플라반-4-올, 안토시아닌 및 안토시아니딘으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 플라보노이드로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 유전자 세트가 제공된다. 다른 양태에 따르면, 다양한 플라보노이드의 생합성 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 유전자 세트로 형질감염시킨 미생물 숙주에서 플라보노이드를 생산하는 방법이 제공된다. 이 방법은 미생물 숙주 세포를 유전자 세트로 형질감염시키는 단계, 이러한 숙주 세포를 상기 유전자의 발현을 허용하는 적당한 증식 배지에서 배양하는 단계, 이 숙주 세포에 적당한 기질을 제공하여 상기 유전자의 발현으로 생산된 효소가 그 기질에 작용하여 목적하는 플라보노이드가 생산될 수 있게 하는 단계를 포함한다. 생산된 플라보노이드는 그 다음 통상의 방법에 따라 정제할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 세트가 도입된 숙주 세포가 제공된다. 상기 유전자 세트는 특정 기질로부터 다양한 플라보노이드를 합성하는 효소를 암호화한다. 도입된 유전자를 발현하는 숙주 세포에 상기 기질이 제공되면, 목적하는 플라보노이드의 합성이 일어난다. 이 플라보노이드는 그 다음 통상의 방법에 따라 정제할 수 있다.