병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 document_id A220623051354

많은 병원체는 급속하게 돌연변이되고 재조합되므로, 효과적인 백신의 생산을 곤란하게 한다. 이러한 문제는 바이러스 병원체, 특히 HIV와 같은 RNA 바이러스에서 가장 우세하다. HIV 감염된 개체는 다중 HIV 균주를 가질 수 있으며, 전형적으로 다중 HIV 유사종을 갖는다. HIV-I과 같은 병원체로 감염된 개체의 치료를 목적으로 하는 치료 전략은 항-바이러스에 내성인 바이러스 균주의 발달로부터 상기 약물의 수많은 부작용에 이르기까지 막대한 난점에 직면하며, 이러한 요법의 계속적인 투여가 곤란하고 비싸지게 한다. 몇몇 치료적 HIV 백신이 개발되었으나, 상기 백신의 임상적 시험은 거의 효능을 나타내지 않았다. 상기 백신의 성공 부재에 대한 한 가지 설명은 HIV 바이러스 게놈의 컨센서스 서열을 포함하는 면역원으로서 바이러스 벡터의 사용이다. 컨센서스 서열의 존재는 반드시 이종 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 있어서 서열의 효능을 입증하지는 않는다. 컨센서스 서열과 자가 감염 HIV 균주 사이의 다양성의 여전히 높고 증대하는 수준 때문에, HIV-I 아형 B 컨센서스 서열을 기재로 한 백신 또는 항-바이러스 시약은 HIV 감염을 적당하게 치료할 수 없다. 더욱이, 상기 바이러스 벡터-기재 백신은 항원 프로세싱 및 제시라는 점에서 면역계의 가장 효과적인 세포, 즉 수지상 세포를 표적화하지 않을 것이다. 다수의 간행물은 HIV에 대한 백신으로서 HIV 핵산 또는 펩티드로 로딩(loading)된 항원 제시 세포의 용도를 암시하였다. 예를 들어 문헌 [Huang et al. J Infect. Dis. 2003 187:315-319]은 리포솜-복합체화된 HFV 단백질로 로딩된 수지상 세포 및 이러한 로딩된 세포의 백신으로서의 가능한 용도를 개시하고 있다. 문헌 [Weissman et al. J Immunol 2000 165:4710-4717]은 단일 클로닝된 HIV gag 서열을 코딩하는 mRNA로 수지상 세포를 형질감염시켜, MHC 부류 I 및 II 분자에 대한 항원성 gag 펩티드의 전달 및 시험관내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 것을 개시하고 있다. 미국 특허 제5,853,719호 및 미국 특허 제6,670,186호 (네어(Nair) 등)는 자가 항원 제시 세포의 시험관내 로딩용으로 환자로부터 단리된 종양 또는 병원체로부터 유래된 RNA의 용도, 및 그의 백신으로서의 용도가 기재되어 있다. 그러나, 총 병원체 RNA로 로딩된 항원 제시 세포를 사용한 환자의 백신화는 환자에서 병원체 로딩 양을 증가시킬 수 있다. 주어진 병원체의 모든 변이체, 특히 HIV의 모든 변이체로부터의 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머를 선택하는데 있어서의 곤란성이 인지되었다. HIV 게놈의 특이적 영역의 증폭은 생체내에서 바이러스의 낮은 정확도 역전사효소 및 면역 선택에 의해 유발되는 HIV 게놈의 높은 돌연변이율로 인해 복잡해진다. 그럼에도 불구하고, 다중 HIV 변이체로부터의 HIV 게놈의 특정 영역을 증폭할 수 있는 프라이머가 개발되었다. 예를 들어 문헌 [Abravaya et al. J Clinical Microbio 2000 38:716-723]에는 혈장에서 HIV-1 군 M 아형 A, B, C, D, E, F 및 G, 및 군 O 및 HIV-2 RNA를 검출하는 다중 PCR 분석에 사용하기 위한 pol 유전자에 보존된 서열에 표적화된 HIV-1-특이적 및 HIV-2-특이적 프라이머 및 프로브, 및 이러한 분석법을 사용하여 혈액 공급의 안정성을 개선하는 것이 개시되어 있다. 문헌 [Christopherson et al. Nucleic Acids Res 1997 25:654-658]에서는 gag의 142 염기쌍 영역을 증폭하는 RT-PCR에서 내부 프라이머-HIV-1 주형 미스매치의 효과를 논의하고 있다. HIV-I 주형 및 프라이머 28 내지 30 염기 길이 사이 중 5 내지 6개 (2 내지 4개가 아님)의 미스매치는 RT-PCR의 수율을 유의하게 감소시켰다. 프라이머는 미스매치를 축적하기 위해 전형적으로 사용되는 것보다 길게 설계되었다. 보다 분기된(divergent) HIV-I 아형 A 및 E의 증폭의 감소된 효율은 어닐링 온도를 50℃로 저하시키고, 온도가 점차 증가하는 역전사 단계를 실시함으로써 4배 내지 10배 개선될 수 있었다. 또한, 5-메틸시토신으로 시토신을 치환하거나, 가변 염기의 위치에서 이노신을 치환하면 상동성 및 가장 일탈하는 HIV-I 주형 사이의 생성 수율이 4배 미만의 차이를 초래하였다. T에서 종결된 프라이머는 C, G 또는 T로 매치되거나 미스매치될 경우 증폭을 가능하게 하였다. 문헌 [Michael et al. J Clin Microbiol 1999 37:2557-2563]은 HIV-I gag 유전자의 155 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 프라이머를 개시하고 있다. 프라이머는 아형 A 내지 G의 30 HIV-I 단리체에 대한 상동성을 최대화하고, 프라이머의 3' 말단 근처의 프라이머 미스매치에 대한 HIV-I을 최소화하도록 선택되었다. 증폭 동안 어닐링 온도를 저하시켜 미스매치 내성을 증가시켰다. 최적화된 프라이머 및 증폭 조건은 이전에 이용가능한 시험에 비해 검출된 HIV-I RNA의 양을 증가시켰지만, 아형 A, D, F 및 G를 과소표시하였고, 아형 H 및 J의 구성원을 함유하지 않았다. 미국 특허 제6,001,558호에는 다중 HIV-I 단리체로부터의 LTR 및 pol 영역, 및 다중 HIV-2 단리체로부터의 LTR, pol 및 env 영역의 짧은 단편 (200 염기쌍 미만)을 증폭하기 위한 다중 프라이머의 용도가 개시되어 있다. 그 후, 다중 프로브를 사용하여 증폭 생성물을 검출하였다. 프라이머/프로브 조합물은 군 M 및 O로부터의 다섯가지 HIV-1 단리체, 및 2가지 HIV-2 단리체를 검출할 수 있었다. HIV-I의 고도로 보존된 서열에 상응하는 프라이머를 하기 기준: 1) 증폭된 PCR 생성물의 길이가 200 염기쌍을 초과할 수 없었는데, 이는 보다 적은 생성물은 보다 큰 생성물에 비해 보다 효과적인 증폭되었기 때문이며, 다른 반응 조건에 대해 덜 민감하기 때문이고; 2) 프라이머 세트는 증폭된 생성물 검출용의 기능적 프로브 영역을 증폭해야만 하고; 3) 프라이머의 3' 말단 근처의 미스매치는 5' 말단 근처의 미스매치보다 훨씬 덜 선호될 것이고; 4) 3' 말단 안정성, 길이 (약 23 내지 31 뉴클레오티드), GC 함량 및 다른 프라이머 및 프로브와의 상호작용에 대한 다른 기준에 의해 선택하였다. 미국 특허 제6,194,142호에는 HIV-I Bru, HIV-I MaI 및 HIV-I Eli, HIV-2 ROD의 gag, pol 및 env 유전자와 SIV MAC 균주 사이, 및 HIV-2 ROD 및 SIV MAC의 nef2, vif2 및 vpx 유전자 또는 HIV-I Bru, HIV-I MaI 및 HIV-I Eli의 env, nefl, vifl 및 vpr 유전자 사이에 보존된 서열에 상응하는 프라이머 쌍을 사용한 시험관내 진단 HIV-I, HIV-2 및 SIV 감염을 위한 방법이 개시되어 있다. HIV 변이체 및 SIV에 상응하는 변이체 뉴클레오티드와 프라이머의 혼합물을 PCR 반응에 동시에 사용하였다. 미국 특허 제6,232,455호에는 31개의 HIV-I 군 M (아형 (A, B 및 D)) 및 군 O 단리체 및 HIV-2 A 및 B 아형의 14개 단리체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프라이머/프로브 세트가 개시되어 있다. HIV-I 컨센서스 프라이머/프로브 세트는 HIV-I의 검출에 대해 특이적인 반면, HIV-2 컨센서스 프라이머/프로브 세트는 HIV-2의 검출에 대해 특이적이다. 미국 특허 제6,531,588호에는 환자에서 다중 HIV 유사종로부터의 pol의 0.7 kB, 1.57 kb 또는 2.1 kb 영역의 증폭 후, 적절한 요법을 결정하고 약물 내성을 모니터링하는데 사용하기 위한 환자-특이적 HIV 유전자형 정보를 결정하기 위한 시퀀싱을 위한 프라이머가 개시되어 있다. 미국 특허 출원 제2003/0148280호에는 순환 재조합 형태 (아형 사이의 재조합을 지칭하는 CFR)을 비롯한 이른바 모든 HIV-I 군 M, N 및 O 균주의 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 및 군간 재조합이 개시되어 있다. 프라이머는 HIV-I gag p24 (399 bp 앰플리콘), pol 인테그라제 (864 bp 앰플리콘), 및 env gp41 면역우세 영역 (IDR; 369 bp 앰플리콘)에 대해 표적화된다. 항원 제시 세포 백신 또는 핵산 백신의 제조를 위한 개체에 존재하는 병원체의 다중 종으로부터의 특정 폴리펩티드를 코딩하는 증폭된 자가 병원체 핵산을 사용하는 가능성은 상기 간행물의 어디에도 암시되지 않았다. 본 발명은 자가 감염 병원체를 치료하기 위한 환자 특이적 백신을 개발하고, 추가의 이점도 제공하기 위한 오래 느껴져온 필요에 요점을 둔다. 발명의 요약 본 출원인은 샘플, 바람직하게는 병원체 감염된 개체로부터의 샘플에 존재하는 임의의 병원체의 다중 변이체 (균주)의 핵산 증폭 방법을 발견하였다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV와 같은 레트로바이러스이다. 증폭된 병원체 핵산은 샘플에 존재하는 병원체 변이체를 확인하고, 샘플에 존재하는 병원체를 정량화하는 데에, 및 핵산 백신으로서, 또는 항원 제시 세포 백신의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포를 형질감염 (로딩)시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염 치료용의 백신으로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포 내로의 사전 로딩 없이 핵산 백신으로서 직접적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고, b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택하는 것을 포함하는, 병원체의 다중 변이체의 증폭에 적합한 프라이머의 선택 방법을 제공한다. 바람직하게는, 후보 전방향 및 역방향 프라이머는 길이가 200 뉴클레오티드 초과인 증폭 생성물, 보다 바람직하게는 길이가 225, 250, 300 이상인 뉴클레오티드를 생성하도록 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 증폭된 핵산은 mRNA를 생성하기 위한 유효한 생체내 또는 시험관내 전사를 위한 전사 및 전사 신호를 함유하고, 그 후 시험관내 또는 생체내에서 번역될 수 있다. 본 출원인은 또한 핵산, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 생산된 mRNA를 사용한, 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포의 로딩 방법을 제공한다. 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염의 치료용의 백신으로서 유용하다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 균주 (변이체)로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산으로 형질감염된 항원 제시 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래될 수 있으며, 상기 병원체 핵산은 상기 포유동물로부터의 것이거나 그로부터 유래된다. 본 발명은 또한 개체를 감염시키는 병원체의 다중 변이체의 대표적인 핵산으로 로딩된 항원 제시 세포의 제조 방법, 및 본 발명의 백신을 사용한 병원체 감염된 개체의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 일 측면에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 뉴클레오티드 서열 변이성을 상쇄하는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 병원체의 제1 및 제2 균주로부터의 폴리펩티드를 배합하여 혼합물을 형성하고; (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터의 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 생성하는 것을 포함하는, 병원체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법을 제공한다. 이러한 앰플리콘은 항원 제시 세포의 형질감염용, 및 시험관내 번역된 병원체 폴리펩티드 생산용의 핵산 백신으로서 사용될 수 있다. 병원체의 다중 균주로부터의 표적화된 병원체 유전자 및 그의 단편을 증폭하는 능력으로 인해 병원체 DNA 또는 RNA 게놈, RNA 바이러스의 전장(full-length) cDNA 카피 등과 같은 총 병원체 핵산을 정제하거나 증폭할 필요가 없다. 예를 들어, 유전자가 핵산 단편의 형태로 존재하든 인접하는 병원체 게놈으로서 존재하든, 핵산 백신으로서 또는 APC 내로의 로딩용으로 완전 HIV 게놈을 제공하는 것은 감염성 바이러스의 재구축(reconstitution)을 초래할 수 있었다. 또한, 특정 병원체 핵산 또는 폴리펩티드 (예를 들어 HIV nef 또는 vpr)는 특히 항원 제시 세포에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 유해한 효과를 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 제거되거나 다른 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대해 보다 적은 몰 비율로 존재할 수 있다. 따라서, 다중 병원체 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 제시하지만 완전한 병원체 게놈보다 덜 제시하거나 병원체 단백질의 전부보다 덜 코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공함으로써, 지속성 감염, 바이러스 유전자 또는 단백질의 구조적 발현과 같은 병원체 감염이 회피될 수 있다. 유해한 병원체 폴리뉴클레오티드 및 단백질 또한 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산은 1종 이상의 개체에 존재하는 다중 병원체 균주로부터의 폴리펩티드를 제시할 수 있다. 증폭된 병원체 핵산은 1종 이상의 병원체 감염된 개체로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 병원체 핵산으로부터 직접적으로 생성될 수 있거나, 병원체의 클로닝된 단리체로부터 생성될 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC)를 제공한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 증폭된 병원체 핵산은 시험관내에서 번역되며, 환자를 백신화하는데 직접적으로 사용되거나, APC를 로딩하는데 사용된다. 병원체 폴리펩티드 또는 이러한 펩티드로 로딩된 APC는 제약상 허용되는 담체와 함께 백신으로서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 단리된 APC를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체-감염된 개체로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 개체에 또는 1종 이상의 다른 개체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하는 자가 백신의 제조 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 병원체-감염된 포유동물로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인, 자가 백신의 제조 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 a. 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체를 상기 병원체의 다중 변이체를 증폭하여 증폭된 병원체 DNA를 생성할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하고; b. 임의로 상기 증폭된 병원체 DNA를 전사하여 병원체 RNA를 생성하고; c. 상기 병원체 DNA 또는 상기 병원체 RNA를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체 감염된 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 임의의 병원체의 핵산을 증폭하는데 사용될 수 있다. 또한, 증폭된 생성물을 로딩하여 로딩된 병원체 (예를 들어 바이러스 로딩)를 측정할 수 있으며, 이를 시퀀싱하여 개체 내의 병원체 진화를 결정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HCV의 HIV이다. 본 발명은 서열 1 내지 58, 60 내지 161 및 172 내지 371로 본질적으로 이루어진 HIV의 다중 변이체의 증폭을 위한 프라이머를 제공하며, 프라이머는 서열 1 내지 58, 60 내지 161 및 172 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 대해 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어지고, 프라이머 쌍은 서열 1 내지 58 및 서열 60 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머의 조합물, 및 서열 1 내지 58 및 60 내지 371에 대해 75％ 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하며, 이러한 프라이머 쌍을 함유하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 열안정성 DNA 폴리머라제, 역전사효소, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 CD40L mRNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 1종 이상의 시약을 함유할 수 있다. 일 측면에서, 본 발명은 HIV DNA의 다중 변이체를 본 발명의 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 것을 포함하는, HIV 서열의 균주-독립성 증폭 방법을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 감염된 환자의 고유한 바이러스 종(들)에 의해 발현된 다중 한정된 HIV 단백질 변이체에서 지정된 치료적 면역 반응을 유도하는 HIV에 대한 자가 백신을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 자가 바이러스로부터 유래된 다중 HIV 항원을 코딩하는 RNA로 형질감염된 자가 생체외 생성된 성숙한 수지상 세포로 이루어진 환자-특이적 백신을 제공한다.