뉴블라스틴 변형체 document_id A220623051357

아르테민 및 이노빈으로도 알려진 뉴블라스틴(Neublastin)은 도파민 작용성 뉴런(neurons) 등과 같은 말초 신경계 및 중추 신경계의 뉴런 생존을 촉진하는 24-kDa의 동형이량체 분비 단백질이다 (Baudet 등, 2000, Development, 127:43335; Rosenblad 등, 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2):199; GenBank AF120274). 뉴블라스틴을 코딩하는 유전자는 이미 클로닝되어 서열이 확인되었다 (Roseblad 등, 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2):199; Baloh 등, Neuron, 21:1291). 뉴블라스틴은 신경교질 세포계-유래 신경성장인자(GDNF) 리간드 패밀리 구성원 중 하나이다. 세포 수준에서, GDNF 구성원들은 수용체 타이로신 키나제 (receptor tyrosine kinase), RET를 활성화시킨다. RET는 공동수용체이며, RET에 리간드 특이성을 제공하는 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 연결된 막 단백질인, GDNF 패밀리 수용체 알파(GFRalpha)와 결합된다. 4종의 GFRalpha가 알려져 있다(GFRalpha 1-4). 뉴블라스틴은 3원 신호전달(signaling) 복합체를 형성하는 RET와 함께 GFRalpha3에 결합하며 (Baudet 등, 2000, Development, 127:43335; Baloh 등, Neuron, 21:1291), 이는 외상수용성 감각 뉴런상에 널리 존재한다 (Orozco 등, 2001, Eur. J. Neurosci., 13(11):2177). 이들 뉴런은 동통 및 외상을 탐지하게 된다. 따라서, 뉴블라스틴은 신경병증의 일반적인 치료 및 보다 구체적으로는 신경병증성 동통 치료 분야에서 임상 적용된다. 뉴블라스틴 및 다른 GDNF 패밀리 구성원들은 TGF 베타(Transforming Growth Factor beta) 수퍼패밀리의 구성원이며, 따라서 시스테인 노트 구조를 형성하는 유사한 간격을 갖는 7개의 보존 시스테인 잔기가 존재하는 특징이 있다 (Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech., 45:292). 각각의 단량체는 단단한 노트 구조를 형성하도록 3번째 이황화 결합을 둘러싼 닫힌 루프 구조를 형성하는 두 개의 이황화 결합을 함유한다. 각각의 단량체 내에 함유된 7번째 시스테인은 내부분자 이황화 결합을 형성하는데, 이는 단량체들을 공유 결합시켜 최종 이량체 산물을 형성시킨다 (Rattenholl 등, 2000, J. Mol. Biol., 305:523). TGF 베타 패밀리 구성원들은 신호(signal) 펩티드와 프로-도메인(pro-domain)이 절단된 후 최종적으로 성숙한 동형이량체로 분비되는 프리(pre) 프로(pro) 단백질로 합성된다 (예를 들어, Rattenholl 등, 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Fairlie 등, 2001, J. Biol. Chem., 276(20):16911 참조). 이들 신호 펩티드 및 프로-도메인은 모두 TFG 베타 패밀리 구성원의 분비가 적절하도록 매개한다 (Rattenholl 등, 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Rattenhol 등, 2001, Eur. J. Neurosci., 268:3296). 본 발명의 요약 본 발명은 적어도 부분적으로 뉴블라스틴이 헤파린 황산염과 결합하며 뉴블라스틴 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기가 이러한 결합에 관여한다는 발견에 기초한다. 선별된 아미노산 잔기의 치환을 통해서 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 의한 헤파린 결합이 감소되고 이들 변형체의 생체활성 및 생체이용도가 증가됨을 발견하였다. 일 측면에 있어서, 본 발명은 서열번호 1의 15 - 113 아미노산에 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드로 특징되며, 상기 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1의 위치 48에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (ii) 서열번호 1의 위치 49에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산으로 치환시킴) ; 및 (iii) 서열번호 1의 위치 51에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산으로 치환시킴)으로 이루어진 군으로 부터 선택된, 서열번호 1에 대해서 하나 이상의 치환을 함유한다. 상기 폴리펩티드는, 이량체화될 때, GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 복합체 (complex)에 결합한다. 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 48 및 위치 49에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산을 함유한다. 예를 들어, 서열번호 1의 위치 48 및 위치 49의 아르기닌 잔기를 비보존 아미노산 잔기 (예를 들어, 글루타민산)로 치환할 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 15 - 113과 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상 동일하다. 또한 본 발명에서 개시하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 15 -113 아미노산, 서열번호 3의 15 -113 아미노산, 서열번호 4의 15 - 113 아미노산, 서열번호 5의 15 -113 아미노산, 서열번호 8의 15 -113 아미노산, 또는 서열번호 9의 15 - 113 아미노산을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 10 - 113 아미노산, 서열번호 3의 10 - 113 아미노산, 서열번호 4의 10 - 113 아미노산, 서열번호 5의 10 - 113 아미노산, 서열번호 8의 10 - 113 아미노산, 또는 서열번호 9의 10 - 113 아미노산을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 함유한다. 또한 본 발명에서 개시하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 15 - 113의 아미노산에 80 % 이상이 동일하며, 상기 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1의 위치 20에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산 (예를 들어, 세린을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (ii) 서열번호 1의 위치 21에 상응하는 위치에 글루타민 이외의 아미노산 (예를 들어, 글루타민을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (iii) 서열번호 1의 위치 32에 상응하는 위치에 히스티딘 이외의 이마노산 (예를 들어, 히스티딘을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (iv) 서열번호 1의 위치 33에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (v) 서열번호 1의 위치 39에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (vi) 서열번호 1의 위치 46에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산 (예를 들어, 세린을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (vii) 서열번호 1의 위치 68에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (viii) 서열번호 1의 위치 72에 상응하는 위치에 글리신 이외의 아미노산 (예를 들어, 글리신을 비보존 아미노산으로 치환시킴); (ix) 서열번호 1의 위치 73에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산 (예를 들어, 세린을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); 및 (x) 서열번호 1의 위치 94에 상응하는 위치에 발린 이외의 아미노산 (예를 들어, 발린을 비보존 아미노산으로 치환시킴)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열번호 1에 대해, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 폴리펩티드는, 이량체화될 때, GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 15 - 113 아미노산에 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상 동일하다. 본 발명에서는 또한 서열번호 1에 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 개시하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1의 위치 7에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (ii) 서열번호 1의 위치 9에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); 및 (iii) 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열번호 1에 대해서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 폴리펩티드는, 이량체화될 때, GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1에 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상 동일하다. 본 발명은 또한, 비자연적으로 발생한 중합체(non-naturally occuring polymer)에 접합된 본 발명에서 기술한 폴리펩티드를 함유하는 접합체(conjugate)를 특징으로 한다. 상기 중합체의 예로는 수용성 합성 중합체 예컨대, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)이다. 본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드 및 이종의 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 접합체, 또는 융합 단백질의 2종을 함유하는 이량체를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 또는 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 본 발명은 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 함유하는 세포를 개시한다. 본 발명은 또한 (i) 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 세포를 핵산 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 융합 단백질, 또는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 포유동물에 투여함으로서 포유동물의 신경계 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 융합 단백질, 또는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 포유동물에 투여함으로서 포유동물의 신경병증성 동통을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 융합 단백질, 또는 약학 조성물의 유효량을 포유동물에 투여함으로서 포유동물에서 RET 수용체를 활성화시키는 방법을 특징으로 한다. 전술한 선별된 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 장점은 야생형 뉴블라스틴과 비교하여 헤파린 결합능이 감소한다는 것이다. 헤파린 결합이 감소하면 생체내에서 변형 폴리펩티드의 제거율 (clearance)이 감소하게 된다. 위치 48 및 위치 49의 아미노산이 치환된 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 단일 아미노산 변이체들 및/또는 야생형 뉴블라스탄에 비해 예상외로 헤파린 결합능이 상당히 감소하며 효능 및 생체이용도가 상당히 증가하는 것을 발견하였다. 예를 들어, 이중 변이체는 야생형 뉴블라스틴에 비해 혈청 노출에 있어서 대략 185 배 증가된 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 이중 변이체는 야생형 뉴블라스틴에 비해 시험관내에서 발현이 5 배 이상 증가하였으며, 그에 따라 단백질의 대량 생산이 용이해졌다. 이들 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 장점 및 예상밖의 특성들로 인해 (야생형 단백질을 사용한 치료 방법에 비해) 낮은 투여량으로 단백질을 사용하여 개체를 치료할 수 있게 되었으며, 및/또는 투여 간격을 늘릴 수 있게 되었다. 달리 한정하지 않으면, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당 업자들에게 일반적으로 통용되는 의미로 사용한 것이다. 본 발명에서 기술한 바와 유사하거나 동일한 방법 및 재료들을 본 발명의 실시 또는 시험을 위해 사용할 수 있으며, 이하 대표적인 방법 및 재료들을 기술한다. 본 발명에서 언급한 모든 출판물, 특허 출원서, 특허, 및 다른 문헌들은 전체로 본 발명의 참조문헌으로 포함한다. 분쟁시, 본 출원은, 정의들을 포함하여, 제어할 수 있다. 본 발명의 재료, 방법 및 구체예들은 단지 설명을 위한 것이며 이에 한정하고자 함은 아니다. 본 발명의 다른 특징 및 장점들은 이하 구체적인 설명, 및 청구항들을 통해 분명해 질 것이다.