전환 성장 인자 베타 패밀리 단백질의 리폴딩 document_id A220623051359

아르테민 및 에노빈으로 알려진 뉴블라스틴은 도파민성 뉴런과 같은 말초 및 중추 신경계의 뉴런의 생존을 촉진시키는 24-kDa 동형이량체 분비된 단백질이다(Baudet et al., 2000, Development, 127:4335; Roseblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2): l99; GenBank(TM) AF120274). 뉴블라스틴을 암호화하는 유전자를 클로닝하였고 서열이 확인되었다(Roseblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2): 199; Baloh et al., Neuron, 21:1291). 뉴블라스틴은 신경교질 세포계-유래 신경성장인자(GDNF) 리간드 패밀리의 구성원이다. 세포 수준에서, GDNF 구성원은 수용체 티로신 키나제, RET를 활성화시킨다. RET는 RET에 대한 리간드 특이성을 제공하는 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 결합된 막 단백질 GDNF 패밀리 수용체 α(GFRα), 공-수용체와 관련이 있다. 4 개의 GFRα가 공지되어 있다(GFRα1-4). 뉴블라스틴은 통각 감각 뉴런(Orozco et al., 2001, Eur. J. Neurosci., 13(11):2177)에 주로 편재되어 있는 3원 시그날 착체(Baudet et al., 2000, Development, 127:4335; Baloh et al., 1998, Neuron, 21:1291)를 형성하는 RET와 함께 GFRα3에 결합된다. 이러한 뉴런은 통증 및 손상을 탐지한다. 그래서, 뉴블라스틴은 신경병증의 일반적인 치료, 보다 상세하게는 신경병증 통증의 치료에서의 임상적 적용을 지닌다. 뉴블라스틴 및 기타의 GDNF 패밀리 구성원은 전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 수퍼패밀리의 구성원이며, 그리하여 시스테인 너트(knot)의 구조를 형성하는 유사한 간격을 갖는 7 개의 보존된 시스테인 잔기의 존재를 특징으로 한다(Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech., 45:292). 각각의 단량체는 제3의 디설피드를 둘러싸는 폐쇄된 루프 구조를 형성하는 2 개의 디설피드를 포함하여 단단한 너트 구조를 형성한다. 각각의 단량체에 함유된 일곱번째 시스테인은 단량체를 공유 결합시키는 분자내 디설피드 결합을 형성하여 최종 이량체 생성물을 형성한다(Rattenholl et al 2000, J. Mol. Biol, 305:523). TGF 베타 패밀리 구성원은 신호 펩티드 및 프로-도메인의 분해후 최종적으로 성숙 동형이량체로서 분비되는 프리 프로 단백질로서 합성된다(예를 들면, Rattenholl, et al., 2000, J. Mol. Biol, 305:523; Fairlie et al., 2001, J. Biol Chem., 276(20): 16911 참조). 신호(signal) 펩티드 및 프로-도메인 모두는 TGF 베타 패밀리 구성원에 대하여 적절한 분비를 조정한다(Rattenholl et al., 2000, J. Mol Biol, 305:523; Rattenholl et al., 2001, Eur. J. Biochem., 268:3296). - 발명의 요약- 본 발명은 적어도 부분적으로는 특정의 완충액 조성물이 변성된 폴리펩티드의 리폴딩을 유도하는데 있어서 특히 효과적이라는 발견에 기초한다. 본 명세서에서 상세하게 설명한 조성물 및 방법이 적절한 3차원 구조를 갖고, 생물학적 활성을 수반하는 폴리펩티드를 생성하도록, 단백질 리폴딩을 유도하도록 개발되었다. 한 구체예에서, 본 발명은 (1) 변성된 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및 (2) 폴리펩티드의 폴딩(folding)을 유도하기에 효과적인 양의 리폴딩 완충액과 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는 변성된 폴리펩티드의 폴딩을 유도하는 방법을 특징으로 하며, 여기서 상기 리폴딩 완충액은 (i) pH 5.8 내지 8.0의 25 mM 내지 150 mM 농도의 인산칼륨 또는 인산나트륨, (ii) 0.3 M 내지 2 M 농도의 구아니딘-HCl, (iii) 0.25 M 내지 1 M 농도의 L-아르기닌, (iv) 0.05% 내지 1% 농도의 Tween-80 및 (v) 1 mM 내지 4 mM 농도의 산화된 글루타티온 및 0.05 mM 내지 0.8 mM 농도의 환원된 글루타티온을 포함하며, 상기 산화된 글루타티온 대 환원된 글루타티온의 비가 5:1 내지 20:1이다. 특정의 구체예에서, 변성된 폴리펩티드는 TGF 베타 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, "TGF 베타 수퍼패밀리 구성원"은 TGF 베타 수퍼패밀리의 야생형 구성원과 동일한 서열을 갖는 단백질, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 절단체 또는, 야생형 단백질(전체 길이 또는 성숙 단백질)에 대한 70% 이상의 서열 동일성을 갖고 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 변이체를 지칭한다. TGF 베타 수퍼패밀리의 구성원의 예로는 TGF-베타, 성장 분화 인자, 골 형태형성 단백질, 액티빈, 인히빈 및 신경교질 세포계-유래 신경성장인자 등이 있다. 특정의 구체예에서, 변이체는 전체 길이 야생형 단백질에 대한 서열 동일성이 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%이고, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 특정의 구체예에서, 변이체는 성숙 야생형 단백질에 대한 서열 동일성이 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이고, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 본 명세서에서 설명한 방법에 사용된 "리폴딩 완충액" 성분의 농도의 설명은 변성된 폴리펩티드와의 반응에 존재하는 리폴딩 완충액 성분의 최종 농도(폴딩 반응의 기타의 성분의 첨가 이전에 리폴딩 완충액의 스톡 용액중의 성분의 농도가 아님)를 지칭한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, "폴리펩티드의 폴딩을 유도하기 위한"이라는 것은 야생형 단백질의 것과 상응하는 폴리펩티드의 3차 구조의 유도, 및 관련된 생물학적 활성의 획득을 의미하는 것이다. TGF 베타 수퍼패밀리 구성원은 신경교질 세포계-유래 신경성장인자(GDNF) 패밀리 구성원이 될 수 있다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이 "GDNF 패밀리 구성원"이라는 것은 GDNF 패밀리의 야생형 구성원과 동일한 서열을 갖는 단백질, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 절단체 또는, 야생형 단백질(전체 길이 또는 성숙 단백질)에 대한 서열 동일성이 70% 이상이고 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 변이체를 지칭한다. GDNF 패밀리의 구성원은 GDNF, 뉴르투린, 뉴블라스틴 및 페르세핀을 포함한다. 특정의 구체예에서, 변이체는 전체 길이 야생형 단백질에 대한 서열 동일성이 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%이고 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 특정의 구체예에서, 변이체는 성숙 야생형 단백질에 대한 서열 동일성이 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%이고, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 특정의 구체예에서, GDNF 패밀리 구성원은 뉴블라스틴 단백질이다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, "뉴블라스틴 단백질"이라는 것은 야생형 뉴블라스틴(예, 인간 뉴블라스틴)과 동일한 서열을 갖는 단백질, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 절단체 또는, 야생형 단백질(전체 길이 또는 성숙 뉴블라스틴 단백질)에 대한 서열 동일성이 70% 이상이고 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 변이체를 지칭한다. 특정의 구체예에서, 변이체는 전체 길이 야생형 단백질에 대한 서열 동일성이 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%이고, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 특정의 구체예에서, 변이체는 성숙 야생형 단백질에 대한 서열 동일성(예, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 108-220)이 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%이고, 야생형 단백질의 생물학적 활성을 보유한다. 뉴블라스틴 단백질은 예를 들면 서열 번호1의 아미노산 잔기 122-220, 서열 번호1의 아미노산 잔기 117-220 또는 서열 번호1의 아미노산 잔기 108-220를 포함하거나 또는 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 리폴딩 완충액과의 폴딩을 유도시키기 이전에 박테리아[예, 대장균(E. coli)]중의 폴리펩티드를 발현시키는 것을 더 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 상기 폴리펩티드를 불용성 형태로 박테리아중에서 발현시키고, 리폴딩 완충액과의 폴딩을 유도시키기 이전에, 폴리펩티드를 변성시키기에 효과적인 양의 가용화 완충액과 불용성 폴리펩티드를 접촉시킨다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.30 M 내지 0.5 M 농도의 L-아르기닌을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.30 M 이상 농도의 L-아르기닌을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.35 M 이상 농도의 L-아르기닌을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.35 M 농도의 L-아르기닌을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 내지 1% 농도의 Tween-80을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 내지 0.5% 농도의 Tween-80을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 이상 농도의 Tween-80을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 농도의 Tween-80을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 5:1 내지 10:1 비율의 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 5:1 비율의 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 1 mM 내지 2 mM 농도의 산화된 글루타티온을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 1 mM 농도의 산화된 글루타티온을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.5 M 내지 1.0 M 농도의 구아니딘-HCl을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.5 M 이상 농도의 구아니딘-HCl을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.5 M 농도의 구아니딘-HCl을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 25 mM 내지 100 mM 농도의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 25 mM 내지 75 mM 농도의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 50 mM 이상 농도의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 50 mM 농도의 인산칼륨을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 pH 7.0 내지 8.0의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 pH 7.5 내지 8.0의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 pH 약 7.8의 인산칼륨을 포함한다. 리폴딩 완충액은 임의로 (i) pH 7.8의 50 mM 농도의 인산칼륨, (ii) 0.5 M의 농도의 구아니딘-HCl, (iii) 0.35 M 농도의 L-아르기닌, (iv) 0.1% 농도의 Tween-80, (v) 1 mM 농도의 산화된 글루타티온 및 (vi) 0.2 mM 농도의 환원된 글루타티온을 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 (i) pH 7.8의 50 mM 농도의 인산칼륨, (ii) 0.5 M의 농도의 구아니딘-HCl, (iii) 0.35 M 농도의 L-아르기닌, (iv) 0.1% 농도의 Tween-80, (v) 1 mM 농도의 산화된 글루타티온 및 (vi) 0.2 mM 농도의 환원된 글루타티온으로 이루어지지 않는다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 우레아 및/또는 글리신이 결핍되어 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 1 내지 10 배로 희석시킬 경우 뉴블라스틴 폴리펩티드의 폴딩을 유도하기에 효과적인 양의 리폴딩 완충액을 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 여기서 리폴딩 완충액은 (i) pH 5.8 내지 8.0의 25 mM 내지 150 mM 농도의 인산칼륨 또는 인산나트륨; (ii) 0.3 M 내지 2 M 농도의 구아니딘-HCl; (iii) 0.25 M 내지 1 M 농도의 L-아르기닌; (iv) 0.05% 내지 1% 농도의 Tween-80; 및 (v) 1 mM 내지 4 mM 농도의 산화된 글루타티온 및 0.05 mM 내지 0.8 mM 농도의 환원된 글루타티온을, 상기 명시한 농도의 1 내지 10 배로 포함하며, 상기 산화된 글루타티온 대 환원된 글루타티온의 비는 5:1 내지 20:1이다. 이러한 조성물은 폴딩 반응을 개시하기 이전에 기타의 성분으로 희석시킨 스톡(stock) 용액으로서 임의로 사용할 수 있다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.30 M 내지 0.5 M 농도의 1 내지 10 배의 L-아르기닌을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.30 M 이상 농도의 1 내지 10 배의 L-아르기닌을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.35 M 이상 농도의 1 내지 10 배의 L-아르기닌을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.35 M 농도의 1 내지 10 배의 L-아르기닌을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 내지 1% 농도의 1 내지 10 배의 Tween-80을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 내지 0.5% 농도의 1 내지 10 배의 Tween-80을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 이상의 농도의 1 내지 10 배의 Tween-80을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.1% 농도의 1 내지 10 배의 Tween-80을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 5:1 내지 10:1 비율의 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 5:1 비율의 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 1 mM 내지 2 mM 농도의 1 내지 10 배의 산화된 글루타티온을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 1 mM 농도의 1 내지 10 배의 산화된 글루타티온을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.5 M 내지 1.0 M 농도의 1 내지 10 배의 구아니딘-HCl을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.5 M 이상 농도의 1 내지 10 배의 구아니딘-HCl을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 0.5 M 농도의 1 내지 10 배의 구아니딘-HCl을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 25 mM 내지 100 mM 농도의 1 내지 10 배의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 25 mM 내지 75 mM 농도의 1 내지 10 배의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 50 mM 이상의 농도의 1 내지 10 배의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 50 mM 농도의 1 내지 10 배의 인산칼륨을 포함한다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 pH 7.0 내지 8.0의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 pH 7.5 내지 8.0의 인산칼륨을 포함한다. 기타의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 pH 약 7.8의 인산칼륨을 포함한다. 리폴딩 완충액은 (i) pH 7.8의 50 mM 농도의 인산칼륨; (ii) 0.5 M의 농도의 구아니딘-HCl; (iii) 0.35 M 농도의 L-아르기닌; (iv) 0.1% 농도의 Tween-80; (v) 1 mM 농도의 산화된 글루타티온; 및 (vi) 0.2 mM 농도의 환원된 글루타티온을 명시한 농도의 1 내지 10 배로 임의로 포함하거나 또는 이들 성분들로 이루어질 수 있다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 (i) pH 7.8의 50 mM 농도의 인산칼륨, (ii) 0.5 M의 농도의 구아니딘-HCl, (iii) 0.35 M 농도의 L-아르기닌, (iv) 0.1% 농도의 Tween-80, (v) 1 mM 농도의 산화된 글루타티온 및 (vi) 0.2 mM 농도의 환원된 글루타티온으로 이루어지지 않는다. 특정의 구체예에서, 리폴딩 완충액은 우레아 및/또는 글리신이 결여되어 있다. 본 명세서에서 설명한 조성물 및 방법은 단백질이 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 생성물로 생성되지 않는 숙주(예, 박테리아)에서 생성되는 환경에서, 뉴블라스틴과 같은 TGF 베타 수퍼패밀리 단백질을 대량으로 적절하게 리폴딩시키고 및 적절하게 리폴딩된 단백질을 정제시킬 수 있다는 점에서 이롭다. 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용한 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의하여 통상적으로 이해될 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 이와 등가의 방법 및 물질을 사용하여 본 발명을 실시 또는 테스트하는데 사용하기는 하였으나, 하기에서는 예시의 방법 및 물질을 설명한다. 본 명세서에서 언급한 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타의 인용 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용하고자 한다. 분쟁의 경우, 정의를 포함한 본 출원을 제어한다. 물질, 방법 및 예는 예로서만 제시하며, 이로써 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 기타의 특징 및 잇점은 하기의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.