시스테인 유전자조작 항체 및 접합체 document_id A220623051458

항체 요법은 암, 면역학적 장애 및 혈관형성성 장애가 있는 환자를 표적화 치료하기 위해 확립되었다. 항체를 사용한 암 진단 또는 치료에 효과적인 세포내 표적을 발견하려는 시도에 있어서, 연구자들은 막횡단, 또는 정상의 비-암성 세포(들)와 비교하여 암 세포 표면에 특이적으로 발현하는 종양-관련 폴리펩티드를 규명하려고 하였다. 이러한 종양-관련 세포 표면 항원 폴리펩티드, 즉 종양 관련 항원 (TAA)의 규명은 항체-기반 치료를 통해 파괴하도록 암 세포를 특이적으로 표적화시킬 수 있게 한다. 암 치료시 종양 세포를 사멸시키거나 억제시키는 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체 (ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 (문헌 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]; [Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146]; [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172], US 4975278), 이론적으로는 상기 약물 부분을 종양에 표적화 전달할 수 있고 종양 내에 약물이 세포내 축적되게 할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 전신 투여하게 되면, 제거시키고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 허용 가능하지 않은 수준의 독성이 야기될 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, "in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506]. 따라서, 최소 독성을 나타내면서 최대 효능을 나타내고자 하였다. ADC를 고안하고 개선시키기 위한 노력들은 약물-연결성 및 약물-방출성 (문헌 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]) 뿐만 아니라 모노클로날 항체 (mAbs)의 선택성에 대해서도 초점을 맞추었다. 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 둘 다가 이들 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87]). 이들 방법에 사용된 약물에는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신 (상기 문헌 [Rowland et al., (1986)])이 포함된다. 항체-독소 접합체에 사용된 독소에는 세균성 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 젤다나마이신 (문헌 [Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581]; [Mandler et al (2000) Bioorganic 0026# Med. Chem. Letters 10: 1025-1028]; [Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791]), 마이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928]; [Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342])이 포함된다. 독소는 투불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 기전에 의해 자신의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 몇몇 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드와 접합될 때 불활성화되거나 덜 활성을 나타내는 경향이 있다. 항체-방사성 동위원소 접합체가 승인되었다. 젤바린(ZEVALIN(등록상표)) (이브리투모마브 티욱세탄, 바이오겐/인덱(Biogen/Idec)사)은 정상 및 악성 B 림포구의 표면에서 발견되는 CD20 항원, 및 티오우레아 링커-킬레이트제에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소에 대항하여 생성된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체로 구성되었다 (문헌 [Wiseman et al (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) Blood 99 (12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 젤바린(등록상표)은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대한 활성을 갖고 있지만, 상기 약물을 투여하면 대부분의 환자에게서 중증의 지속성 혈구감소증이 나타났다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MYLOTARG™ (젬투주마브 오조가미신, 와이어스 파마슈티칼즈(Wyeth Pharmaceuticals)사]은 주사하여 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25 (7):686]; 미국 특허 제4970198호; 동 제5079233호; 동 제5585089호; 동 제5606040호; 동 제5693762호; 동 제5739116호; 동 제5767285호; 동 제5773001호). 디술피드 링커 SPP를 통하여 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 칸투주마브 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.)사) (문헌 [Xie et al (2004) J. of Pharm. and Exp. Ther. 308 (3):1073-1082])은, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위해 제II상 시험을 진행 중에 있다. MLN-2704 (밀레니움 팜(Millennium Pharm.)사, 비제트엘 바이올로직스(BZL Biologics)사, 이뮤노겐, 인크.)는 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체로서, 현재 전립선 종양의 잠재적 치료를 위해 개발 중이다. 돌라스타틴의 합성 동족체인 아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (WO 02/088172)은, (i) 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y(Lewis Y)에 특이적임); (ii) 혈액학적 악성 종양 상의 CD 30에 특이적인 cAC1O (문헌 [Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]; [Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]; [Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465], US 2004/0018194); (iii) CD20-발현 암 및 면역 장애의 치료를 위한 항-CD20 항체, 예컨대 리툭산 (WO 04/032828); (iv) 직장결장 암의 치료를 위한 항-EphB2R 항체 2H9 및 항-IL-8 (문헌 [Mao et al (2004) Cancer Research 64(3):781-788]); (v) E-셀렉틴 항체 (문헌 [Bhaskar et al (2003) Cancer Res. 63:6387-6394]); 및 (vi) 다른 항-CD30 항체 (WO 03/043583)에 접합되어 있다. 아우리스타틴 E의 변이체는 US 5767237 및 US 6124431에 개시되어 있다. 모노클로날 항체에 접합된 모노메틸 아우리스타틴 E는, 2004년 3월 28일에 공개된 문헌 [Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623]에 개시되어 있다. 아우리스타틴 동족체 MMAE 및 MMAF는 다양한 항체에 접합되어 있다 (WO 2005/081711). 약물 부분의 항체와의 통상적인 부착 방법, 즉 공유 결합을 통한 결합 방법은, 일반적으로 약물 부분이 항체의 다수 부위에 부착되는 분자의 이질성 혼합물을 생성시킨다. 예를 들어, 세포독성 약물은 항체의 종종-다수의 리신 잔기를 통해 항체에 접합되어 이질성 항체-약물 접합체 혼합물을 생성시킨다. 반응 조건에 따라, 이질성 혼합물은 약물 부분에 부착되는 0개 내지 약 8개 이상의 항체 분포를 함유한다. 또한, 약물 부분 대 항체의 특정 정수 비율을 갖는 접합체의 각 하위군 내에, 약물 부분이 항체 상의 다양한 부위에 부착되는 잠재적 이질성 혼합물이 존재한다. 분석 방법 및 제조 방법은, 접합 반응으로 생성된 이질성 혼합물 내에서 항체-약물 접합체 종을 분리하여 특징규명하는데 부적당하다. 항체는, 종종 다수의 반응성 관능기를 가지고 크고 복합적이며 다양한 구조의 생분자이다. 링커 시약 및 약물-링커 중간체의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 공-용매와 같은 요인에 따라 달라진다. 더욱이, 다단계 접합 공정은, 반응 조건을 제어하고 반응물 및 중간체를 특징규명하기 어렵기 때문에 재현가능하지 않을 수 있다. 양성자가 부가되어 pH 7 근처에서 덜 친핵성인 대부분의 아민과는 다르게 시스테인 티올은 중성 pH에서 반응성이다. 유리 티올 (RSH, 술프히드릴)기가 비교적 반응성이기 때문에, 시스테인 잔기를 갖는 단백질은 종종 디술피드-결합 올리고머와 같은 그의 산화 형태로 존재하며 내부 다리 디술피드 기를 갖는다. 세포외 단백질은 일반적으로 유리 티올을 가지지 않는다 (문헌 [Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, at page 55]). 단백질 내 유리 티올의 양은 표준 엘만(Ellman) 분석법으로 평가할 수 있다. 이뮤노글로불린 M은 디술피드-결합 펜타머의 예이며, 한편 이뮤노글로불린 G는 서브유닛을 함께 결합시키는 내부 디술피드 다리를 갖는 단백질의 예이다. 상기와 같은 단백질에서, 디티오트레이톨 (DTT) 또는 셀렌올과 같은 시약과의 디술피드 결합의 환원 (문헌 [Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-156])이 반응성 유리 티올을 생성시키는데 요구된다. 이러한 접근법은 항체 3차 구조 및 항원 결합 특이성을 손실시킬 수 있다. 항체 시스테인 티올기는, 일반적으로 친전자성 접합 시약에 대해 항체 아민 또는 히드록실기 보다 더 반응성, 즉 더 친핵성이다. 시스테인 잔기는 유전자공학 기술에 의해 단백질 내로 도입되어 리간드와 공유 부착을 형성하거나 신규 분자내 디술피드 결합을 형성한다 (문헌 [Better et al (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650]; [Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132]; [Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255]; [Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867]; [Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214]; [Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484], US 6248564). 그러나, 단백질의 다양한 아미노산 잔기의 시스테인 아미노산으로의 돌연변이에 의한 시스테인 티올기의 디자인은, 특히 쌍을 이루지 않은 (유리 Cys) 잔기 또는 반응 또는 산화에 대해 비교적 접근가능한 잔기의 경우에 잠정적으로 문제가 있다. 단백질 농축 용액에서, 이.콜라이(E. coli)의 원형질인 배양 상등액, 또는 부분 또는 완전하게 정제된 단백질에서, 단백질의 표면 상의 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기는 쌍을 이루고 산화되어 분자간 디술피드를 형성함으로써 단백질 이량체 또는 다량체를 형성한다. 디술피드 이량체 형성은, 약물, 리간드, 또는 다른 표지의 접합에 비반응성인 새로운 Cys를 제공한다. 더욱이, 단백질이 산화하여 새로운 유전자조작 Cys와 존재하는 Cys 잔기 간의 분자내 디술피드 결합을 형성하는 경우에, Cys 잔기 둘 다는 활성 부위 참여 및 상호작용에 이용될 수 없다. 더욱이, 단백질은 3차 구조로 접히지 않거나 이 구조가 손실됨으로써 불활성 또는 비-특이적이 될 수 있다 (문헌 [Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9]). 요약 본 발명의 화합물은, 모 항체의 1개 이상의 아미노산이 유리 시스테인 아미노산으로 대체되는 시스테인 유전자조작 항체를 포함한다. 시스테인 유전자조작 항체는, 티올 반응성 값이 0.6 내지 1.0 범위인 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산을 포함한다. 유리 시스테인 아미노산은, 모 항체로 유전자조작되는 시스테인 잔기이며, 디술피드 다리의 일부가 아니다. 한 국면에서, 시스테인 유전자조작 항체는 (a) 모 항체의 1개 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체하는 단계; 및 (b) 시스테인 유전자조작 항체를 티올-반응성 시약과 반응시킴으로써 시스테인 유전자조작 항체의 티올 반응성을 측정하는 단계 를 포함하는 방법으로 제조한다. 상기 시스테인 유전자조작 항체는 모 항체보다 티올-반응성 시약과의 반응성이 더 클 수 있다. 유리 시스테인 아미노산 잔기는, 불변 또는 가변 도메인의 중쇄 또는 경쇄에 위치할 수 있다. 항체 단편, 예를 들어 Fab는 항체 단편의 아미노산을 대체하는 1개 이상의 시스테인 아미노산으로 유전자조작하여 시스테인 유전자조작 항체 단편을 형성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 국면은 (a) 1개 이상의 시스테인 아미노산을 모 항체로 도입시켜 시스테인 유전자조작 항체를 생성시키는 단계; 및 (b) 시스테인 유전자조작 항체의 티올-반응성 시약과의 티올 반응성을 측정하는 단계 를 포함하며, 상기 시스테인 유전자조작 항체는 모 항체보다 티올-반응성 시약과의 반응성이 더 큰, 시스테인 유전자조작 항체의 제조 방법을 제공한다. 시스테인 유전자조작 항체의 제조 방법에서 단계 (a)는 (i) 시스테인 유전자조작 항체를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이유발시키는 단계; (ii) 시스테인 유전자조작 항체를 발현시키는 단계; 및 (iii) 시스테인 유전자조작 항체를 단리하여 정제하는 단계 를 포함할 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체의 제조 방법에서 단계 (b)는 파지 또는 파지미드 입자로부터 선택되는 바이러스 입자 상에 시스테인 유전자조작 항체를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체의 제조 방법에서 단계 (b)는, 또한 (i) 시스테인 유전자조작 항체를 티올-반응성 친화성 시약과 반응시켜 친화성 표지된 시스테인 유전자조작 항체를 생성시키는 단계; 및 (ii) 친화성 표지된 시스테인 유전자조작 항체와 포획 배지와의 결합을 측정하는 단계 를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 국면은 (a) 1개 이상의 시스테인 아미노산을 모 항체로 도입시켜 시스테인 유전자조작 항체를 생성시키는 단계; (b) 시스테인 유전자조작 항체를 티올-반응성 친화성 시약과 반응시켜 친화성 표지된 시스테인 유전자조작 항체를 생성시키는 단계; (c) 친화성 표지된 시스테인 유전자조작 항체와 포획 배지와의 결합을 측정하는 단계; 및 (d) 시스테인 유전자조작 항체의 티올-반응성 시약과의 티올 반응성을 측정하는 단계 를 포함하는, 시스테인 유전자조작 항체의 티올 반응성에 대해 고도 반응성이며 쌍을 이루지 않은 시스테인 아미노산으로의 스크리닝 방법이다. 시스테인 유전자조작 항체 스크리닝 방법에서 단계 (a)는 (i) 시스테인 유전자조작 항체를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이유발시키는 단계; (ii) 시스테인 유전자조작 항체를 발현시키는 단계; 및 (iii) 시스테인 유전자조작 항체를 단리하여 정제하는 단계 를 포함할 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체 스크리닝 방법에서 단계 (b)는, 파지 또는 파지미드 입자로부터 선택되는 바이러스 입자 상에 시스테인 유전자조작 항체를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체 스크리닝 방법에서 단계 (b)는 또한 (i) 시스테인 유전자조작 항체를 티올-반응성 친화성 시약과 반응시켜 친화성 표지된 시스테인 유전자조작 항체를 생성시키는 단계; 및 (ii) 친화성 표지된 시스테인 유전자조작 항체와 포획 배지와의 결합을 측정하는 단계 를 포함할 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체는 암 치료에 유용할 수 있으며, 세포 표면 및 막횡단 수용체 및 종양-관련 항원 (TAA)에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 순수한(naked; 약물 또는 표지 부분과 접합되지 않은) 항체로 또는 화학식 I 항체-약물 접합체 (ADC)로 사용할 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체의 제조 방법 또는 스크리닝 방법의 실시양태는, 모 항체가 hu4D5Fabv8과 같은 항체 단편인 경우를 포함한다. 모 항체는 또한 알부민-결합 펩티드 서열 (ABP)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 모 항체는 또한 huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (트라스투주마브)로부터 선택되는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명의 시스테인 유전자조작 항체는 티올-반응성 시약과 부위-특이적으로 및 효율적으로 커플링될 수 있다. 티올-반응성 시약은 다관능성 링커 시약, 포획 표지 시약, 형광단 시약 또는 약물-링커 중간체일 수 있다. 시스테인 유전자조작 항체는 고상 지지체 상에 고정화되고/되거나 약물 부분과 접합된 검출가능 표지로 표지될 수 있다. 본 발명의 또 다른 국면은 시스테인 유전자조작 항체 (Ab) 및 약물 부분 (D)을 포함하는, 화학식 I의 항체-약물 접합체 화합물이며, 여기서 상기 시스테인 유전자조작 항체는 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산을 통해 링커 부분 (L)에 의해 D에 부착되며, 모 항체의 1개 이상의 아미노산 잔기를 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산으로 대체하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 식 중에서, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 약물 부분으로는, 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 동족체 또는 유도체를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 예시적인 약물 부분은 DM1, MMAE 및 MMAF를 포함한다. 화학식 I의 항체-약물 접합체는 추가로 알부민-결합 펩티드 (ABP) 서열을 포함할 수 있으며; 그 구성식은 화학식 Ia이다. 본 발명의 또 다른 국면은 시스테인 유전자조작 항체 또는 시스테인 유전자조작 항체-약물 접합체 및 생리학상 또는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이다. 치료 용도를 위한 상기 조성물은 멸균되며, 동결건조할 수 있다. 본 발명의 또 다른 국면은 본원에 개시되는 화합물의 진단 용도 및 치료 용도를 포함한다. 제약 조성물은 화학식 I의 화합물 및 1종 이상의 화학요법제의 조합물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 국면은, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 이들의 증식을 억제시키는데 유효한 양의 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물로 상기 세포를 치료하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포의 사멸 또는 이들의 증식 억제 방법이다. 본 발명의 다른 국면은, 유효량의 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 암; 자가면역 질환; 또는 감염성 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암; 자가면역 질환; 또는 감염성 질환의 치료 방법을 포함한다. 본 발명의 또 다른 국면은, 포유동물의 ErbB 수용체가 과발현되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법이다. 포유동물은 접합되지 않은 항-ErbB 항체를 사용한 치료에 임의로 반응하지 않거나 불충분하게 반응한다. 상기 방법은 치료 유효량의 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 국면은, HER2 수용체 및 EGF 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체 화합물, 및 화학요법제를, 각각 환자의 종양 세포 성장을 억제시키는데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 성장 인자 수용체를 과발현하는 종양 세포의 성장 억제 방법이다. 본 발명의 또 다른 국면은, 유효량의 항체-약물 접합체 화합물과 화학요법제의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, ErbB2 수용체의 과발현을 특징으로 하는 장애에 민감하거나 이로 진단받은 인간 환자의 치료 방법이다. 본 발명의 또 다른 국면은, 세포를 항체-약물 접합체 화합물에 노출시키는 단계, 및 항체-약물 접합체 화합물과 세포와의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 암 세포 검출을 위한 검정 방법이다. 본 발명의 또 다른 국면은 항체-약물 접합체 화합물; 용기; 및 상기 화합물이 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낸 패키지 설명서 또는 라벨을 포함하는 제조품이다.