분리된 계통 음성 조혈 줄기세포 및 이를 사용한 치료 방법 document_id A220623051612

노화 관련 황반변성 (ARMD) 및 당뇨성 망막병증 (DR)은 산업화된 국가들에서 시력 상실의 주된 원인이며 비정상적 망막 혈관신생 (neovascularization)의 결과로서 발생한다. 망막은 신경세포 요소, 아교 요소 및 혈관 요소의 매우 명확한 층으로 이루어지기 때문에, 혈관 증식 또는 부종에서 보여지는 바와 같이 비교적 작은 장애라도 현저한 시기능 상실을 유발할 수 있다. 망막 색소변성 (RP)과 같은 유전성 망막 변성도 또한 세동맥 협착 및 혈관 위축과 같은 혈관 비정상성과 연관이 있다. 대부분의 유전성 사람 망막 변성은 구체적으로 간체 광수용체에 영향을 주지만, 중추, 미세 시력을 책임지는 사람 망막의 영역인 황반의 주요 세포 성분인 추체의 상실이 수반된다. 추체-특이적 생존 인자가 최근에 보고되었으며 (MohandSaid et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 95: 8357-8362), 이는 망막 변성의 마우스 모델에서 추체 생존을 촉진할 수 있다. 유전성 망막 변성은 3500명 중 1명꼴로 다수가 앓고 있으며, 진행성 야맹증, 시야 상실, 시신경 위축, 세동맥 약화, 혈관 투과성 변경, 및 완전 실명으로 종종 진행되는 중심 시력 상실을 특징으로 한다[참조: Heckenlively, J.R., editor, 1988; Retinitis Pigmentosa, Philadelphia; JB Lippincott Co.]. 이러한 질환의 분자 유전학 분석은, 공지된 질환자 중 비교적 적은 비율에서만 원인이 되는 110개 이상의 상이한 유전자에서 돌연변이를 확인하였다[참조: Humphries et al., 1992, Science 256:804-808; Farrar et al., 2002, EMBO J.21: 857-864]. 다수의 이들 돌연변이들은 로돕신, cGMP 포스포디에스터라제, rds 페리페린 및 RPE65를 비롯한 광변환 기구의 효소 성분 및 구조 성분과 관련이 있다. 이러한 발견에도 불구하고, 이러한 망막 변성 질환의 진행을 지연 또는 역전시키는 효과적인 치료법은 여전히 없는 상황이다. 최근 유전자 요법의 진보는 특정 돌연변이를 보유한 동물의 광수용체 또는 망막 색소상피 (RPE)로 야생형 전이유전자 (transgene)가 전달될 때, 마우스의 rds 표현형[참조: Ali et al. 2000, Nat. Genet. 25:306-310] 및 rd 표현형[참조: Takahashi et al., 1999, J. Virol. 73:7812-7816]과 개의 RPE65 표현형[참조: Acland et al., 2001, Nat. Genet. 28:92-95]의 역전을 성공적으로 이끌었다. 다년간, 줄기세포 집단이 정상 성인 순환계 및 골수에 존재한다는 것은 공지되어 왔다. 이러한 세포들의 상이한 아집단은 조혈 계통 양성 (Lin+) 또는 계통 음성 (Lin-) 계통을 따라서 분화할 수 있다. 또한, 계통 음성 조혈 줄기세포 (HSC) 집단은 최근에 시험관내 및 생체내에서 혈관을 형성할 수 있는 내피 전구세포 (EPC)를 함유하는 것으로 밝혀졌다[참조: Asahara et al. 1997, Science 275:964-7]. 이들 세포는 정상적 및 병리학적 출생후 혈관형성 (angiogenesis)에 관여할 수 있을 뿐만 아니라[참조: Lyden et al. 2001, Nat. Med. 7:1194-201; Kalka et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:3422-7; and Kocher et al. 2001, Nat. Med. 7:430-6], 간세포[참조: Lagasse et al. 2000, Nat. Med. 6:1229-34], 미세아교세포[참조: Priller et al. 2002, Nat. Med. 7:1356-61], 심근세포[참조: Orlac et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:10344-9] 및 상피[참조: Lyden et al. 2001, Nat. Med. 7:1194-201]를 포함하는 각종 비-내피 세포형으로 분화할 수 있다. 이들 세포가 혈관형성의 몇가지 실험 모델에서 사용되어왔다 해도, 신생혈관계를 표적으로 하는 EPC의 기전은 공지되어 있지 않으며, 특정 혈관계에 기여하는 세포의 수를 효과적으로 증가시킬 전략은 확인되지 않았다. 골수 유래의 조혈 줄기세포는 현재 치료용으로 통상적으로 사용되는 줄기세포의 유일한 종류이다. 골수 HSC는 40년 이상 동안 이식에 사용되어왔다. 현재, 정제된 줄기세포를 수거하는 진전된 방법이 백혈병, 림프종 및 유전성 혈액 질환들을 치료하기 위한 요법의 개발을 위해 연구되고 있다. 사람 줄기세포의 임상 적용이 제한된 수의 사람 환자에게서 당뇨병 및 진행성 신장암의 치료를 위해 검토되고 있다. 발명의 개요 본 발명은 안 질환을 앓고 있는 포유동물의 망막에서 추체 세포 변성을 개선하는 방법을 제공한다. 본 방법은, 포유동물의 골수-유래 분리된, 조혈 줄기세포 및 내피 전구세포를 포함하는 계통 음성 조혈 줄기세포 집단을 포유동물의 망막에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 망막에서 추체 세포 변성을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 바람직한 방법은, 안 질환을 앓고 있는 포유동물의 골수로부터 내피 전구세포를 포함하는 계통 음성 조혈 줄기세포 집단을 분리한 다음, 분리된 줄기세포를 망막의 추체 세포의 변성을 개선하기에 충분한 수로 포유동물의 안구에 유리체내로 주사함을 포함한다. 본 발명의 방법은, 포유동물 골수로부터 유래된, 분리된 포유동물의 계통 음성 조혈 줄기세포 (Lin- HSC) 집단 (즉, 세포 표면 상에 계통 표면 항원 (Lin)을 발현하지 않는 조혈 줄기세포 (HSC))를 이용한다. 바람직하게는, 상기 세포는 자가 줄기세포 (즉, 치료될 포유동물 개체의 골수로부터 유래)이다. 분리된 포유동물의 Lin- HSC 집단은, 안구에 유리체내로 주사되는 경우에, 활성화된 망막 성상세포를 선택적으로 표적으로 하는, 내피 선조세포로도 알려진 내피 전구세포 (EPC)를 포함한다. 바람직하게는, 포유동물은 사람이다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 Lin-HSC 집단은, 안 질환을 앓고 있는 포유동물로부터 골수를 추출하는 단계; 골수로부터 복수의 단핵구를 분리하는 단계; 당해단핵구를 1종 이상의 계통 표면 항원에 대한 바이오틴-접합된 계통 패널 항체로 표지시키는 단계; 계통 표면 항원에 대해 양성인 단핵구를 제거하는 단계; 및 EPC를 함유하는 Lin-HSC 집단을 회수하는 단계를 통해 분리된다. 바람직하게는, 단핵구는 CD2, CD3, CD4, CD11, CD11a, Mac-11, CD14, CD16, CD19, CD24, CD33, CD36, CD38, CD45, Ly-6G, TER-119, CD45RA, CD56, CD64, CD68, CD86, CD66b, HLA-DR 및 CD235a (글리코포린 A)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 계통 표면 항원에 대한 바이오틴-접합된 계통 패널 항체로 표지된다. 바람직하게는, 본 발명의 분리된 Lin-HSC 집단의 세포 중 약 20% 이상은 표면 항원 CD31을 발현한다. 이어서, 분리된 세포를 바람직하게는 안내 주사로 포유동물의 질환에 걸린 안구에 투여한다. 바람직한 태양에서, 분리된 Lin- HSC의 약 50% 이상은 표면 항원 CD31을 발현하고, 분리된 Lin- HSC의 약 50% 이상은 표면 항원 CD117 (c-kit)를 발현한다. 본 발명의 Lin- HSC 집단 내의 EPC는 광범위하게 발달중인 망막 혈관 및 망막의 신경세포 망으로 침입하여, 안구의 신생혈관계 및 신경세포 망 내로 안정하게 혼입되어 유지된다. 정상 마우스 망막은 간체 (rod)가 우세하지만, 본 발명의 방법에 의해 치료된 마우스에서, Lin- HSC를 사용한 치료 후 구제된 세포는 놀랍게도 거의 모두 추체였다. 바람직한 일 태양에서, 분리된 Lin-HSC 집단의 세포는 치료학적으로 유용한 유전자로 형질감염된다. 예를 들면, 당해 세포는 신생혈관계를 선택적으로 표적화하여, 세포-기반 유전자 요법 형태를 통해 이미 확립된 혈관에 영향을 주지 않으면서 새로운 혈관 형성을 억제하는, 신경영양제 및 항-혈관형성제를 작동가능하게 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염될 수 있다. 일 태양에서, 본 발명의 방법에서 유용한 분리된 Lin-HSC 집단은 혈관형성 억제성 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함한다. 혈관형성 억제성 Lin-HSC는 ARMD, DR 및 비정상적 혈관계와 관련 있는 특정의 망막 변성과 같은 질환에서 비정상적 혈관 성장을 조절하는데 유용하다. 또 다른 바람직한 태양에서, 본 발명의 분리된 Lin-HSC는 신경영양성 펩티드를 암호하는 유전자를 포함한다. 당해 신경영양성 Lin-HSC는 녹내장, 망막 색소변성 등과 같은 망막 신경 변성을 포함한 안 질환의 신경세포의 구제를 촉진하는데 유용하다. 본 발명의 분리된 Lin-HSC 집단을 이용한 안구 치료법의 특별한 이점은 Lin-HSC로 유리체내로 치료된 안구에서 관찰되는 혈관영양성 및 신경영양성 구제 효과이다. 본 발명의 분리된 Lin-HSC로 치료된 안구에서, 망막 신경세포 및 광수용체, 특히 추체가 보존되고 시기능이 어느 정도 유지될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 치료될 질환에 걸린 망막은 활성화된 성상세포를 포함한다. 이는 관련 신경아교증이 있을 때 안구를 조기 치료하거나, 또는 레이저를 사용하여 활성화된 성상세포의 국소 증식을 자극함으로써 달성될 수 있다.