옥수수 이벤트 ＤＡＳ-59122-7 및 그의 탐지 방법 document_id A220623051898

본 발명의 양태는 해충 저항성 옥수수 (제아 마이스: Zea mays) 식물 DAS-59122-7 (이는 옥수수 계통 DAS-59122-7 또는 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로서 지칭되기도 한다); 옥수수 식물 DAS-59122-7의 DNA 식물 발현 구조물; 및 옥수수 식물 DAS-59122-7 및 그의 자손에게서 형질전환유전자 (transgene)/플랭킹 (flanking) 삽입 영역을 탐지하는 것에 관한 것이다. 옥수수는 중요한 작물이고 전 세계 여러 지역에서 주요 식품원으로 이용되고 있다. 화학적 살충제와 같은 보호 조치를 취함에도 불구하고, 전 세계 옥수수 작물 손실에 있어서의 주요 원인은 해충에 의한 피해이다. 이러한 관점에서, 해충 피해를 방제하고 전통적인 화학적 살충제에 대한 필요성을 감소시키기 위해, 옥수수 등의 작물을 유전 공학적으로 처리하여 해충 저항성을 부여하였다. 형질전환 (transgenic) 해충 저항성 작물을 생산하기 위해 활용되어 온 유전자들 중의 하나가 바실루스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis: B.t.)로부터의 델타-내독소이다. 델타-내독소는 옥수수 뿐만 아니라 목화, 감자, 벼, 해바라기 등의 작물에도 성공적으로 발현되었고, 해충 전반에 걸쳐 탁월한 방제를 제공하는 것으로 입증되었다 [참고: Perlak, F.J. et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; PCT 공개특허공보 WO 01/13731; and Bing JW et al. (2000) Efficacy of CryIF Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO]. 외래 유전자가 식물에서 발현하는 것은 식물 게놈 내에서의 그의 위치에 의해 영향을 받는 것으로 공지되어 있는데, 이는 염색질 구조 (예: 이종-염색질) 때문이거나 전사 조절 요소 (예: 증강인자)가 통합 부위에 아주 근접하여 위치하기 때문인 것으로 추정된다 [참고: Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988]. 이와 동시에, 형질전환유전자가 게놈 내의 상이한 위치에 존재하는 것은 식물의 전반적인 표현형에 상이한 방식으로 영향을 미칠 것이다. 이러한 이유로 인해, 관심있는 도입된 유전자를 최적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 이벤트 (event)를 확인 (동정)하기 위해서는 다수의 이벤트를 스크리닝하는 것이 종종 필요하다. 예를 들어, 식물 및 기타 유기체에서는, 이벤트들 간에 도입된 유전자의 발현 수준에 광범위한 차이 (변동)이 있을 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한, 공간적 또는 시간적 발현 패턴 상의 차이, 예를 들어 각종 식물 조직 내에서의 형질전환유전자의 상대적 발현 상의 차이가 있을 수 있는데, 이는 도입된 유전자 구조물 내에 존재하는 전사 조절성 요소로부터 예상되는 패턴에 상응하지 않을 수 있다. 이러한 이유로 인해, 수백 내지 수천 가지의 상이한 이벤트를 생성시키고, 이들 이벤트를 대상으로 하여 상업적 목적에 요망되는 형질전환유전자 발현 수준과 패턴을 나타내는 단일 이벤트를 스크리닝하는 것이 통상적이다. 목적하는 형질전환유전자 발현 수준 또는 패턴을 나타내는 이벤트는, 통상적인 육종 방법을 사용하여 유성 이계-교배함으로써 형질전환유전자를 다른 유전적 배경 내로 유전자 이입하는데 유용한다. 이러한 교배 자손은 본래 형질전환체의 형질전환유전자 발현 특징을 유지하고 있다. 이러한 전략을 사용하여 국소 생육 환경에 잘 맞도록 적응시킨 수 많은 변종에서 신뢰할 만한 유전자 발현을 보장한다. 유성 교배 자손이 관심있는 형질전환유전자를 함유하고 있는지를 결정하기 위해, 특정한 이벤트가 존재하는지를 탐지할 수 있는 것이 유리할 것이다. 또한, 특정한 이벤트를 탐지하는 방법은 시장에 출하하기 전에 승인을 받아야 하는 규정에 따르고, 예를 들어 재조합 작물로부터 유래된 식품에 라벨을 붙여 분류하는데 도움을 주거나, 또는 대상체가 규제 또는 계약 조항에 따르도록 하는데 사용할 뿐만 아니라 환경적으로 모니터링하거나, 현지 작물의 특징을 모니터링하거나 또는 작물 수확으로부터 유래된 생성물을 모니터링하는데 사용하기 유용할 것이다. 핵산 프로브를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 DNA 혼성화를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 모든 핵산 탐지 방법에 의해 형질전환유전자의 존재 여부를 탐지하는 것이 가능하다. 이들 탐지 방법은 일반적으로, 자주 사용되고 있는 유전적 요소들, 예를 들어 프로모터, 종결인자, 마커 유전자 등에 촛점을 맞추고 있는데, 이는 많은 DNA 구조물의 경우에는 암호화 영역이 상호 교환가능하기 때문이다. 그 결과, 상기 방법들은 삽입된 이종 DNA와 인접한 플랭킹 DNA의 DNA 서열이 공지되어 있지 않은 경우에는, 특히 동일한 DNA 구조물 또는 극히 유사한 구조물을 사용하여 생성시킨 상이한 이벤트들 간을 식별하는데 유용하지 않을 수 있다. 예를 들어, 엘리트 (elite) 이벤트 GAT-ZMl을 탐지하기 위한 이벤트-특이적 PCR 검정이 미국 특허 제6,395,485호에 기재되어 있다. 따라서, 이벤트 DAS-59122-7을 확인 (동정)하기 위한 간단하고도 차별적인 방법이 요망된다. 발명의 요약 본 발명의 양태는 해충 저항성 단자엽 작물을 생성 및 선별하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 식물 세포 및 식물에서 발현된 경우에 해충 저항성을 부여해주는 DNA 구조물이 제공된다. 본 발명의 한 국면에 따르면, 식물 세포 및 식물에서 발현된 경우에 이러한 식물 세포 및 식물에 해충 저항성을 부여해주는, 숙주 세포 내로 도입되어 복제할 수 있는 DNA 구조물이 제공된다. 이러한 DNA 구조물은 PHI17662A로 명명된 DNA 분자로 구성되고, 이에는 3개의 형질전환유전자 발현 카세트가 포함된다. 제1 발현 카세트는 감자로부터 분리한 Pin II 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122]에 작동가능하게 연결된, Cry34Abl로서 확인된 B.t. δ-내독소를 암호화하는 DNA 분자 [참고: 미국 특허 제6,127,180호, 제6,624,145호 및 제6,340,593호]에 작동가능하게 연결된, 프로모터, 5' 비해독 엑손, 및 옥수수 유비퀴틴 (Ubi-1) 유전자의 제1 인트론을 포함하는 DNA 분자 [참고: Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 and Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218]를 포함한다. DNA 구조물의 제2 형질전환유전자 발현 카세트는 감자로부터 분리한 Pin II 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122]에 작동가능하게 연결된, Cry35Abl로서 확인된 B.t. δ-내독소를 암호화하는 DNA 분자 [참고: 미국 특허 제6,083,499호, 제6,548,291호 및 제6,340,593호]에 작동가능하게 연결된, 밀 (wheat) 퍼옥시다제 프로모터를 암호화하는 DNA 분자 [참고: Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:171-174]를 포함한다. DNA 구조물의 제3 형질전환유전자 발현 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S로부터의 3' 전사 종결인자를 포함하는 DNA 분자 [참고: Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59]에 작동가능하게 연결된, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 유전자를 암호화하는 DNA 분자 [참고: Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70:25-37]에 작동가능하게 연결된, (CaMV) 35S 프로모터의 DNA 분자 [참고: Odell J.T. et al (1985) Nature 313:810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37:49-59]를 포함한다. 이러한 DNA 구조물을 함유하는 식물이 또한 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, DAS-59122-7로 명명된 신규한 옥수수 식물을 확인하기 위한 조성물 및 방법이 제공되는데, 이러한 방법은 DAS-59122-7의 5' 및/또는 3' 플랭킹 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브를 기초로 한다. PCR 반응에 활용된 경우에 형질전환 이벤트 DAS-59122-7에 대해 독특한 앰플리콘 (amplicon)을 생성시킬 프라이머 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공된다. 이들 분자는 다음 서열들 및 그의 상보체들로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다: 이들 분자를 포함하는 옥수수 식물 및 종자가 본 발명의 한 양태이다. 추가로, DAS-59122-7 이벤트를 확인하기 위해 이들 프라이머 서열을 활용하는 키트가 제공된다. 본 발명의 부가의 양태는 본원에 기재된 DAS-59122-7의 특이적 플랭킹 서열에 관한 것인데, 이는 생물학적 샘플 중에서 DAS-59122-7을 특이적으로 확인하는 방법을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 보다 특히, 본 발명은 DAS-59122-7의 5' 및/또는 3' 플랭킹 영역, 즉 서열 19, 5' 플랭킹 영역 및 서열 20, 3' 플랭킹 영역에 관한 것인데, 이는 특이적 프라이머와 프로브를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태는 상기 특이적 프라이머와 프로브의 사용을 기초로 하여, 생물학적 샘플 중에 DAS-59122-7이 존재하는지를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 특정 샘플 중에서 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 상응하는 DNA의 존재 여부를 탐지하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 추출된 게놈성 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용된 경우에, 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘을 생성시키는 DNA 프라이머 세트를, DNA를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 앰플리콘을 생성시키는 단계; 및 (c) 이러한 앰플리콘을 탐지하는 단계를 포함한다. 신규한 형질전환유전자/플랭킹 삽입 영역, 서열 21, 5' 플랭킹 + 1000개 내부 서열 및 서열 22, 3' 플랭킹 + 1000개 내부 서열을 포함하고, 서열 21 및 서열 22와 상동성이거나 이에 상보적인 DNA 분자가 본 발명의 한 양태이다. 신규한 형질전환유전자/플랭킹 삽입 영역, 서열 21을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 한 양태이다. 옥수수 식물 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘 생성물을 생성시키기 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열 21의 옥수수 식물 DAS-59122-7로부터의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 옥수수 게놈 및/또는 플랭킹 서열과, 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 형질전환유전자 삽입물 서열을 포함하는 DNA 서열이 포함된다. 또한, 신규한 형질전환유전자/플랭킹 삽입 영역, 서열 22를 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 옥수수 식물 DAS-59122-7에 대한 진단인자인 앰플리콘 생성물을 생성시키기 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열 22의 옥수수 식물 DAS-59122-7로부터의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 옥수수 게놈 및/또는 플랭킹 서열과, 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드의 형질전환유전자 삽입물 서열을 포함하는 DNA 서열이 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열 21 또는 그의 상보체의 DNA 서열의 형질전환유전자 부분의 적어도 11개 이상의 뉴클레오티드와, 서열 21 또는 그의 상보체의 유사한 길이의 5' 플랭킹 옥수수 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열이 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생성된 앰플리콘이 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자이다. 따라서, 본 발명의 양태에는 또한, 서열 21과 상동성이거나 이에 상보적인 DNA 프라이머에 의해 생성된 앰플리콘이 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열 22 또는 그의 상보체의 DNA 서열의 형질전환유전자 부분의 적어도 11개 이상의 뉴클레오티드와, 서열 22 또는 그의 상보체의 유사한 길이의 3' 플랭킹 옥수수 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열이 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생성된 앰플리콘이 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대한 진단인자이다. 따라서, 본 발명의 양태에는 또한, 서열 22와 상동성이거나 이에 상보적인 DNA 프라이머에 의해 생성된 앰플리콘이 포함된다. 보다 구체적으로는, DNA 프라이머 세트를 포함하는 DNA 분자 쌍이 본 발명의 양태인데, 이러한 DNA 분자는 서열 18 또는 그의 상보체와 서열 1 또는 그의 상보체; 서열 2 또는 그의 상보체와 서열 17 또는 그의 상보체; 서열 10 또는 그의 상보체와 서열 9 또는 그의 상보체; 서열 8 또는 그의 상보체와 서열 17 또는 그의 상보체; 및 서열 36 또는 그의 상보체와 서열 37 또는 그의 상보체로서 확인된다. 본 발명의 추가 양태에는 서열 18과 서열 1의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 서열 2와 서열 17의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 서열 10과 서열 9의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 서열 8과 서열 17의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘; 및 서열 36과 서열 37의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘이 포함된다. 본 발명의 추가 양태에는 다음 프라이머가 포함되는데, 이들은 이벤트 DAS-59122-7를 탐지하거나 성상 확인하는데 유용하다: 서열 11 또는 그의 상보체; 서열 5 또는 그의 상보체; 서열 4 또는 그의 상보체; 서열 7 또는 그의 상보체; 서열 6 또는 그의 상보체; 서열 3 또는 그의 상보체; 서열 18 또는 그의 상보체; 서열 14 또는 그의 상보체; 서열 13 또는 그의 상보체; 서열 15 또는 그의 상보체; 서열 17 또는 그의 상보체; 서열 16 또는 그의 상보체; 및 서열 12 또는 그의 상보체. 추가의 양태에는 또한, 상기 열거된 프라이머들의 쌍을 형성함으로써 생성된 앰플리콘이 포함된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 엄격한 혼성화 조건 하에 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 추출한 DNA와 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 옥수수 식물 DNA와는 혼성화하지 않는 DNA 프로브 분자를, 옥수수 식물로부터 추출한 DNA를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 이러한 샘플과 프로브에 엄격한 혼성화 조건을 적용하는 단계; 및 (c) 상기 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 탐지하는 단계를 포함하여, 특정 샘플 중에서 DAS-59122-7 이벤트에 상응하는 DNA 분자의 존재 여부를 탐지하는 방법이 제공된다. 보다 구체적으로는, (a) DAS-59122-7 이벤트에 대해 독특한 서열, 예를 들어 연접부 서열로 이루어진 DNA 프로브 분자 [이러한 DNA 프로브 분자는 엄격한 혼성화 조건 하에 옥수수 이벤트 DAS-59122-7로부터 추출한 DNA와 혼성화하지만, 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 옥수수 식물 DNA와는 혼성화하지 않는다]를, 옥수수 식물로부터 추출한 DNA를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 이러한 샘플과 프로브에 엄격한 혼성화 조건을 적용하는 단계; 및 (c) 상기 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 탐지하는 단계로 이루어진, 특정 샘플 중에서 DAS-59122-7 이벤트에 상응하는 DNA 분자의 존재 여부를 탐지하는 방법이 제공된다. 또한, 서열 23 내의 DAS-59122-7 특이적 영역을 탐지하는, 특정 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 키트 및 방법이 제공된다. 서열 32, 33, 34 및 35, 및 그들의 상보체로 이루어진 군 중에서 선택된 DAS-59122-7의 하나 이상의 연접부 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공되는데, 연접부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종 DNA와, 삽입 부위를 플랭킹하는 옥수수 세포로부터의 DNA, 즉 플랭킹 DNA 간의 연접부에 걸쳐 있고, DAS-59122-7 이벤트에 대한 진단인자이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) 해충에 대한 저항성을 부여해 주는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 제1의 모 옥수수 계통과, 해충 저항성이 결여된 제2의 모 옥수수 계통을 유성 교배함으로써, 복수 개의 자손 식물을 생성시키는 단계; 및 (b) 해충 저항성인 자손 식물을 선별하는 단계를 포함하여, 해충 저항성 옥수수 식물을 생성시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 자손 식물을 제2의 모 옥수수 계통과 역교배시켜 해충 저항성인 진성 (true)-육종 옥수수 식물을 생성시키는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태는 옥수수 세포를 DNA 구조물 PHIl7662A (서열 24)로 형질전환시키는 단계; 이와 같이 형질전환시킨 옥수수 세포를 옥수수 식물로 성장시키는 단계; 해충에 대한 저항성을 나타내는 옥수수 식물을 선별하는 단계; 및 옥수수 식물을 번식력이 있는 (fertile) 옥수수 식물로 추가로 성장시키는 단계를 포함하여, 해충에 대해 저항성인 옥수수 식물을 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 번식력이 있는 옥수수 식물은 자가 수분할 수 있거나 또는 상용성인 옥수수 변종과 교배하여 해충 저항성 자손을 생산할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 추가로, 생물학적 샘플 중에서 옥수수 이벤트 DAS-59122-7를 확인하기 위한 DNA 탐지용 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 PCR 확인 프로토콜에 사용하기 위한, DAS-59122-7의 5' 또는 3' 플랭킹 영역을 특이적으로 인식하는 제1 프라이머와, DAS-59122-7의 외래 DNA 내의 서열 또는 플랭킹 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 제2 프라이머를 포함한다. 본 발명의 추가의 양태는 생물학적 샘플 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위한 키트에 관한 것이고, 이러한 키트는 이벤트 DAS-59122-7의 특이적 영역과의 서열 동일률이 80% 내지 100%인 서열과 상응하거나 이에 상보적인 서열을 갖는 특이적 프로브를 포함한다. 이러한 프로브 서열은 이벤트 DAS-59122-7의 5' 또는 3' 플랭킹 영역의 일부를 포함하는 특이적 영역에 상응한다. 본 발명의 양태에 포괄되는 방법 및 키트는 상이한 목적을 위해, 예를 들어 식물, 식물성 재료 또는 생성물 [이에는 식물성 재료를 포함하거나 이로부터 유래된 식품 또는 사료 생성물 (신선하거나 가공됨)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다] 중에서 이벤트 DAS-59122-7을 확인하기 위하여 사용될 수 있고; 부가적으로 또는 또 다른 한편으론, 상기 방법 및 키트를 사용하여, 형질전환 재료와 비-형질전환 재료 간을 분리시킬 목적으로 형질전환 식물성 재료를 확인할 수 있으며; 부가적으로 또는 또 다른 한편으론, 상기 방법 및 키트를 사용하여, 옥수수 이벤트 DAS-59122-7을 포함하는 식물성 재료의 질을 결정할 수 있다. 키트는 또한, 탐지 방법을 수행하는데 필요한 시약과 재료를 함유할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태는 DAS-59122-7 옥수수 식물 또는 그의 일부에 관한 것인데, 그의 일부에는 옥수수 식물 DAS-59122-7 및 그로부터 유래된 자손의 화분, 배주, 생장 세포, 화분 세포 핵, 및 난 세포 핵이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. DNA 프라이머 분자가 특이적 앰플리콘 생성물을 제공하는 옥수수 식물 및 종자 DAS-59122-7이 본 발명의 특정 양태이다. 본 발명의 상기 국면 및 기타 국면은 다음의 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 보다 명백해질 것이다.