재조합 항체의 재접힘 방법 document_id A220623052188

유전공학의 대두는 유전적으로 조작된 유기체에서 기능적 형태의 생물학적 의미가 있는 폴리펩타이드를 대량으로 용이하게 생산할 수 있을 것이라는 희망을 가져다 주었다. 많은 경우, 원핵생물체가 재조합 단백질의 발현에 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 희망은 여러가지 이유로 인하여 완전히 실현되지 못하고 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드가 생산되어 숙주의 세포질에 머무르는 많은 경우에, 생성된 봉입체(inculsion body)로 인하여 단백질의 변성 및 탈변성이 요구되나. 이는 많은 경우 단지 부분적으로 성공하거나 또는 거의 성공하지 못한다. 많은 중요한 표적 단백질은 원핵세포에서는 가장 성공적인 경우라도 수용성 형태로는 매우 비효율적으로 발현되며, 이는 적어도 부분적으로는 생체네에서의 단백질 접힘과정의 복잡성에 기인한다 (Houry et al., Nature, 402: 147-154, 1999). 봉입체로부터 생물적으로 활성있는 진핵 단백질의 회수는 카오트로픽제(chaotropic agent) 및 환원성 티올의 사용을 포함하는 거친 조건에서 수행되는 단백질의 접힘 및 재접힘과정을 거쳐야 한다. 다른 경우에는 발현된 단백질 또는 펩타이드는 상당히 분해되어, 수율이 낮을 뿐아니라 분리 및 정제를 어렵게 하는 복잡한 혼합물을 생성한다. 생체내 단백질에서의 이황화 결합의 형성은 복잡한 과정이며, 환경의 산화환원전위 및 특화된 티올-이황화 교환 효소에 의해 결정된다 (Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984; Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44, 2002; Ritz and Beckwith, Roles of thiol-redox pathways in bacteria, Annu. Rev. Microbiol. 55, 21-48, 2001.). 이황화결합은 신생 폴리펩타이드 사슬의 엔도플라즈믹 레티쿨럼내로의 분비과정 중에 또는 이로 분비된 직후에 형성된다 (Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984). 동일한 단백질이나 상이한 이황화 구조를 갖는 수개의 구조적 아이소형(isoform) 단백질이 재조합 단백질이 생성되는 동안 포유류 세포에서 생성되며, 이는 단백질 구조에서 세개 이상의 시스테인이 근접하게 있는 경우 또는 짝이 없는 시스테인 잔기가 표면에 노출된 경우에 이황화 결합 형성 과정의 실패에 기인한다. 일반적으로, 단백질(항체, IgG 항체, IgG1 항체 및 인간 IL-15에 결합하는 IgG1 항체를 포함) 중의 시스테인 잔기는 시스테인-시스테인 이황화 결합에 관여하거나 단백질 접힘 영역의 부분인 경우는 이황화결합이 형성되지 않도록 공간적으로 보호 되어 있다. 시스테인 잔기가 단백질 구조에서 쌍을 이루지 않으며, 접힘에 의해 공간적으로 보호되지 않는 경우는 용액 중의 자유 시스테인과 이황화 결합을 형성한다 (시스테닐화). 자유 시스테인 잔기는 단백질의 형성의 단위체인 다른 아미노산과 함께 통상적으로 배양배지에 포함되어 있다. 시스테닐화는 약학 단백질에서는 바람직하지 않은 후번역 변형으로 이로 인해 원치않는 특성, 예컨대 낮은 결합성 및 낮은 생물학적 활성 및 낮은 안정성을 갖는 구조적 아이소형 단백질이 형성될 수 있다. 본 발명은 시스테닐화가 일어나지 않고 목적하는 구조의 아이소형태 단백질의 상대적 양을 증가시키는 방법 및 시스테닐화의 제거방법을 제공한다. 단백질 중의 짝짖지 않은 시스테인 잔기는 시스테닐화가 일어날 수 있으며, 이는 단백질의 특성 및 기능에 중대한 변화를 가져올 수 있다. 단백질의 시스테닐화는 생체내 단백질에서도 보고되었다 (Craescu et al., J. Biol. Chem. 261, 14710-14716, 1986; Dormann et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 16286-16292; Davis et al., Biochemistry 1996, 35, 2482-2488; Lim et al., Anal. Biochem. 2001, 295, 45-56., Bondarenko et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 2002, 219, 671-680). 시스테인 잔기의 변형은 단백질의 활성을 변화시킨다. 예를 들면, 글루타치온의 헤모글로빈에의 공유결합은 이 단백질의 산소-결합 특성을 증가시킨다 (Craescu et al., J. Biol. Chem. 261, 14710-14716, 1986). 다른 예에서, 간에서 발견되는 유형의 지방산 결합 단백질 (LABP)은 시스테닐화 및 글루타치오닐화 후에 결합 친화성을 잃어 버린다 (Dormann et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 16286-16292). HIV-1 프로테아제의 활성은 시스테닐화 및 글루타치오닐화를 통하여 조절된다 (Davis et al., Biochemistry 1996, 35, 2482-2488). 혈액 중의 인간 항체 중에도 적은 양이지만 짝짖지 않은 시스테인이 있는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 한 보고서에 따르면, 람다유형의 면역글로블린 경쇄는 33번 위치에 자유 시스테인이 있으며, 경쇄는 총 6개의 시스테인 잔기를 포함한다 (Buchwald et al., Can. J. Biochem. 1971, 49, 900-902). 이러한 자유시스테인은 람다 경쇄의 서브그룹 III의 특징이다. 짝짓지 않은 시스테인이 IgG 분자에 존재하는 것으로 보고되었으나, 짝짖지 않은 시스테인의 시스테닐화가 보고된 경우는 없다. 시스테닐화의 검출에 분석적 어려움이 있을 수도 있으며, 종전의 보고서에서 시스테닐화를 검출하지 못한 것은 분석의 한 단계에서 환원과정이 사용되었기 때문일 수 있다 (환원은 시스테닐화를 제거한다). CDR 영역 중에 존재하는 시스테닐화는, 인간 IL-15에 대한, 완전히 인간 항체인 146B7의 경우에서 보는 바와 같이 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다. 재접힘에 의한 시스테닐화의 제거는 단백질 이질성을 최소하는데 도움을 주어 단백질 산물의 균질성을 향상시킨다. 재접힘에 의한 시스테닐화의 제거는 또한 산물의 효능을 증가시킨다. 시스테닐화는 하나 이상의 짝짓지 않은 시스테인을 포함하는 다른 IgG 분자에 존재할 가능성이 많기 때문에 시스테닐화의 제거는 이러한 산물의 약학적 활성의 중요한 요소이다. PCT 공보 WO 02/68455는 종양괴사인자 수용체 Fc-융합 단백질의 재접힘 과정에 대하여 개시한다. 상기 단백질은 IgG1 항체의 Fc 영역을 두 개의 종양 괴사인자 수용체 (TNFr)와 융합하는 조작에 의해 만들어진 것으로 자연적으로 나타나지 않는다. 상기 문헌은 하나 이상의 자유 또는 짝짖지 않는 시스테인, 즉 이황화 결합에 참여하지 않는 시스테인의 존재로 인하여 이질적 구조를 갖는 단백질에 대하여는 다루지 않는다. 자유 시스테인을 갖는 복잡한 단백질이 존재하는 것으로 알려져 있으며 적어도 일부 면역글로불린은 상업적 관련이 있는 이러한 단백질의 예이다. 특히, WO 02/68455는 면역글로불린과 같은 자연적으로 나타나는 분자의 처리의 예는 물론 자유 또는 짝짖지 않는 시스테인을 포함하는 복잡하고 큰 단백질의 단백질-접힘 문제에 대하여도 논의하거나 다루지 않는다. 미생물 세포 (E. coli)에 의해 생산된 봉입체 단백질의 시험관내 접힘에 대하여는 문헌에 잘 기재되어 있으며 두 가지 단계를 포함한다. 첫째는 모든 이황화결합을 제거하기 위하여 봉입체 단백질이 높은 농도의 카오트로픽제 및 환원제에서 가용화된다 (Middelberg, A. P. Preparative protein refolding. Trends Biotechnol. 2002 , 20, 437-443). 예를 들면, Rudolph, R.; Lilie, H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J. 1996 , 10, 49-56에서 봉입체의 가용화 용액은 6 M 구아니딘 하이드로클로리드 및 100mM DTT를 포함한다. 두번째 단계에서, 중간 정도 농도의 구아니딘 하이드로클로리드 (0.5 M ~1.0 M) 및 약한 산화환원 환경에서의 단백질 접힘이다 (Middelberg, A. P. Preparative protein refolding. Trends Biotechnol. 2002 , 20, 437-443). 본 발명은 고농도의 카오트로픽 및 환원제의 존재 중에서의 단백질의 모든 이황화 결합의 완전한 변성 및 환원을 통한 가용화 단계를 포함하지 않는다. 본 발명의 방법은 단백질을 변성시키지 않으며, 변성하는 경우라도 단지 수개의 이황화결합 만을 산화환원(결합을 복구 (reshuffle))할 뿐이다. 본 발명은 포유류 세포에서 생산하는 단백질에 관련된 것이다. 이러한 포유류 세포에 의한 생산은 생체내 단백질 접힘 및 이황화결합 형성을 포함하는 것으로, 이는 미생물에서 생산되는 고 농도의 접히지 않은, 비가용성의 혼재된 이황화결합을 갖는 단백질 응집체 (봉입체)와 대비되는 것이다. 포유류 세포는 대부분의 이황화 결합을 올바르게 연결하기 때문에, 완전한 단백질의 변성 및 모든 이황화결합을 환원을 필요로 하지 않는다. U.S. Patent No. 4,766,205는 재조합 단백질의 생산은, 부적절한 분자내 이황화결합의 형성에 의해 난관에 봉착하며, 이러한 난관으로 인해 용이하게 천연상태의 구조적 형태로 전환될 수 없다는 의미에서 "동결된," 비-천연적 형태의 재조합단백질을 생산하게 된다. 이러한 비-천연 산물은 적어도 부분적으로는 생물학적으로 불활성이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 U.S. Patent No. 4,766,205는 단백질의 환원제에의 노출, 부가-형성 이황화 결합 화합물의 첨가 및 그 후의, 환원제의 임시적 배위 제거기능을 갖는 환원제의 첨가를 포함한다. 상기 발명의 상세한 설명에는 단백질을 완전히 변성시켜 가용화하고 이황화결합을 환원시킨다고 기재하고 있다. 관여된 단계 및 요구되는 화합물의 수를 고려하면 상기 방법은 소모적인 접근법이다. U.S. Patent No. 4,766,205는 그러나 포유류 세포에서 생산된 단백질의 재접힘 과정의 사용에 관한 논의 및 면역글로불린과 같은 분자간 결합에 의해 형성된 거대한 복잡한 단백질에 관하여는 전혀 논의하고 있지 않다는 것은 주목하여야 한다. 상기 논의는 생산된 폴리펩타이드가 활성이 있는 구조적 형태로 제공되거나 또는 손쉽게 처리되어 기능적 상태로 되돌아 갈 수 있는 형태로 제공될 수 있는, 예를 들면 재조합 수단을 통한 목적 단백질 생산과 관련하여, 활성이 있는 거대 폴리펩타이드의 효율적이고, 경제적인 생산, 정제 및 분석 시스템 개발에 대한 절실한 필요성이 있다는 것을 보여준다. 부가하여 인슐린과 같은 저분자량 단백질 또는 큰 단백질의 저분자량 소화체(digest)의 분석에 상당하게 사용되어온 기술의 존재에도 불구하고, 큰 단백질, 특히, 분자간 상호작용에 의해 형성된 두개이상의 서브유니트를 갖는 단백질에 관한 서열 및 자세한 구조적 형태 정보를 제공하는 추가의 기술 및 방법에 대한 필요성도 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키기 위한 것이다.