진성 적혈구증가증에 있는 ＪＡＫ2 돌연변이의 확인 document_id A220623052216

바퀘즈 폴리글로불리아(진성 적혈구증가증 또는 PV)는 진성 직혈구증가증, 및 종종 혈소판증가증 및 과다백혈구증가증(hyperleukocytosis)과 관련이 있는 만성 척수증식성 질환이다. 이는 클론성, 후천성 조혈성 줄기세포 질환이다. PV의 조혈성 전구체(progenitor)는 에리트로포이에틴(Epo)의 부재하에 적아세포(erythroblast) 콜로니를 형성할 수 있으며, "자발성 콜로니"로 불린다. 몇 개의 다른 성장인자에 대한 PV 적아세포 전구체의 과민감성은 다음과 같다: 인터루킨-3(IL-3), 과립구 대식세포-촉진 인자(GM-CSF), 줄기세포 인자(SCF) 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1). 여러 연구팀에서는 PV의 생리병리학(physiopathology)에 관심을 가졌으나, 질병 초기의 분자적 이형(anomaly)은 지금까지도 알려지지 않은 채로 남아 있다(H.Pahl, 2000). 몇 개의 사이토카인에 대한 PV 전구체의 과민감성은 사이토카인 수용체에 대해 공통적인 신호 전달 과정과 관련이 있는 비정상성을 연구하도록 유도한다. 분자 마커(marker)의 존재는 PV에서는 전혀 증명되지 않았지만, 다른 척수증식성 질환, 특히 CML과 PV 간의 유사성은 있으며, 이의 분자 메커니즘이 악성 클론 증식과 이의 말단 돌연변이의 유력한 원인이 되는 Ber-Abl에 의해 유도되는 것과 밀접한 관련이 있을 가능성이 있다. 이 가설은 최근에 두 개의 희귀한 척수증식성 질환 즉, FGF 수용체의 구조적 활성을 유도하는 8p11 염색체 부위를 포함하는 전좌와 관련이 있는 척수증식성 질환 및 크립틱 염색체 결실이 키메라 유전자 PDGFRα-FIP1L1을 유발하는 과다호산백혈구증식성(hypereosinophilic) 질환에서 확인되었다. 이 두 경우에 분자적 이형은 구조적 티로신 키나제 활성을 갖는 융합 단백질의 원인이 된다. PV에서, 재발성 세포유전학적 이형(anomaly)은 발견되지 않았으며, 심지어는 20q 결실이 환자의 10 내지 15%에서 검출되었고, 환자의 약 30%에서는 9p에서 이형접합적 결실이 검출되었다(Kralovics, 2002). 그러나, 이러한 이형은 상기 질병에 대해 특이적이지는 않다. PV 세포가 Epo-의존적이지 않기 때문에, 연구는 Epo 수용체(R-Epo)의 경로에 대해 수행되었다. 먼저, 상기 수용체는 구조적 및 기능적으로 모두 정상적이다(Hess et al, 1994; Le Couedic et al, 1996; Means et al, 1989). Epo 촉진이 끝날 때 R-Epo 및 JAK2를 탈인산화시키는 SHP-1 포스파타제는 RNA 및 단백질 레벨에서 정상적으로 발현된다(Andersson et al, 1997; Asimakopoulos et al, 1997). R-Epo 신호전달의 후반 하류(downstream)에서는 PV를 나타내는 환자의 PNN (polynuclear neutrophilis)에서 비정상적인 STAT5 활성이 밝혀졌고, STAT3의 구조적 인산화는 14명의 피검자 중에서 4명의 PV 환자에 있는 PNN에서 발견되었다(Roder, 2001). 마지막으로, STAT5의 전사적 표적인 항-아폽토시스(apoptosis) 단백질인 bcl-xl의 발현이 면역조직학 및 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 연구되었다(Silva et al, 1998). bcl-xl이 PV 적아세포에서 과발현되며, 특히 상기 단백질이 정상적으로는 더 이상 발현되지 않는 훨씬 더 성숙한 단계에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 현재까지 바퀘즈 폴리글로불리아에 있는 최고의 진단 항목은 임상이다(PVSG criteria: Pearson, 2001). 생물학적 진단은 Epo의 부재하에 적혈구의 전구체를 배양하는 것에 필수적으로 기초한다(내인성 콜로니의 검출). 적절한 수행을 위한 전문적 기술이 필요하고 상당한 "테크니션타임(techniciantime)"이 요구되기 때문에, 이러한 테스트는 모든 경우에 유용하지는 않으며, 숙련된 실험실에서 수행될 때에만 신뢰성이 있다. 아울러, 테스트는 높은 민감성을 얻기 위해 환자로부터의 수질 세포를 필요로 하지만, 이는 환자에게는 귀찮은 과정이다. 감법(subtraction) 혼성화 기술을 이용함으로써, 독일 연구팀에서는 PRV1 (Polycythemia Rubra vera 1)이라 불리는 PV의 PNN에서 과발현된 유전자를 클로닝하였다(Temerinac et al, 2000). PRV-1 단백질은 uPAR 표면 수용체의 수퍼패밀리에 속한다. PV 다핵성 호중성 백혈구(polynuclear neutrophil)에 있는 PRV-1을 코딩하는 mRNA의 과발현은 실시간 RT-PCR에 의해 쉽게 검출될 수 있으며; 생리병리학적 기능을 가지고 있지 않은 최근에 밝혀진 질병 마커를 형성한다. 그러나, 최근에 공개된 연구에서는 이것이 매우 민감하거나 매우 특이적이지 않음을 보여준다. 스피박 등의 문헌(Spivak J L et al, 2003, "Chronic myeloproliferative disorders"; Hematology, 2003; 200 24)에서는 특정 PV 마커에 대해 기술한다. 호중성 백혈구 항원 NBI/CD177의 mRNAs는 PV 환자의 과립구에서 과발현되어 있다. 이 마커는 PV를 검출하는데 있어서 믿을만한 수단으로 보이지 않는데, 그 이유는 어떤 환자는 이러한 과발현을 나타내지 않거나 또는 이러한 과발현이 바퀘즈 폴리글로불리아보다는 척수증식성 질환을 겪고 있는 환자에서 관찰되기 때문이다. 혈소판 상에 있는 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 수용체 Mp1의 감소된 발현도 PV에서 발견되었다. 비록 이러한 비정상이 PV에서 유력하게 나타나지만, 다른 척수증식성 질환에서도 나타난다. 아울러, 이는 수행하기 힘들고 고도로 숙련된 실험자에서만 수행될 수 있는 테스트이다. 따라서, 당업계에는 PV를 믿을만하게 진단할 수 있는 방법이 존재하지 않는다. 아울러, 유일한 이용가능한 치료조차도 특이적이지 않다. 이들은 정상적인 수준 내에서 헤마토크릿(hematocrit)을 유지하기 위한 정맥절개(phlebotomy)와 연관이 되어 있거나, 세포독성 시약 또는 IFN의 사용과 연관되어 있다. 본 발명에서, 본 발명자들은 테스트된 환자의 약 90%에서 JAK2 유전자의 돌연변이를 발견했을 뿐만 아니라, 이러한 돌연변이가 티로신 키나제의 구조적 활성을 위해 필요하다는 사실을 발견했으며, 이의 저해가 PV 적아세포의 자연적 증식 및 분화를 차단하도록 한다는 것을 보였다. JAK2는 여러 개의 세포질내 티로신 키나제와 함께 그룹을 이루는 야누스 키나제(JAKs) 패밀리에 속한다: JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2. JAK 단백질은 사이토카인 수용체, 보다 구체적으로는 Epo 수용체(R-Epo)의 수퍼패밀리의 일부와 같이, 내인성 티로신 키나제 활성을 갖지 않는 많은 막 수용체의 세포내 신호와 관련이 있다. JAK2 단백질은 23개의 엑손을 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. 상보적 DNA의 크기는 3,500 염기쌍이며 1,132 아미노산 단백질(130 kD)을 코딩한다(도 1). PCR과 시퀀싱을 이용하여, 본 발명자들은 PV 환자의 거의 90%에서 발견되는 JAK2의 엑손 12 내의 클론성, 후천적 점 돌연변이를 확인하였다. 정상적으로 발린(V)을 코딩하는 "GTC" 617 코돈이 페닐알라닌(F)을 코딩하는 "TTC"로 돌연변이되었다. 상기 V617F 돌연변이는 테스트된 25명의 대조군 또는 2차 폴리글로불리아에 걸린 환자에서는 확인되지 않았다. 반면, 특발성(essential) 혈소판증가증의 40% 및 골수섬유증의 50%에서는 확인되었는데, 이는 이러한 돌연변이가 Bcr-Abl 한정된 만성 골수성 백혈병과 같은 새로운 척수증식성 질환 구조를 정의함을 의미한다. 본 발명의 변이체인 JAK2 V617F가 혈액학 진단 실험실에서 광범위하게 사용되는 기기를 이용해 유효하게 검출될 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 척수증식성 질환을 겪는 것으로 추정되는 환자로부터 119개의 샘플을 분석하였다. 본 발명자들은 JAK2 V617F가 시퀀싱보다 조금 더 민감한 LightCycler® 및 TaqMan®　기술에 의해 효과적으로 검출됨을 확인하였다. 이후, 본 발명자들은 처음에 언급한 진단 테스트로 헤마토크릿 레벨이 51% 이상인 88명의 환자에서 JAK2 V617F의 검출 값을 추정하였으며, 적혈구증가증의 경우 돌연변이가 100%의 양성 예측 값을 갖는 WHO 규범(criteria)(R=0.879) 및 PVSG 규범(R=0.717)에 따른 PV 진단에 부합한다는 것을 나타내었다. 이러한 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 과립구에 있는 JAK2 V617F의 검출이 적혈구증가증이 있는 환자에서 맨 먼저 고려되어야 하는 진단 테스트로 간주되어야 하며, 이로 인해 적혈구 중량의 측정, 골수 방법 및 내인성 적혈구 콜로니 형성의 시험관내 분석을 수행하지 않아도 됨을 제시한다. 또한, 이러한 검출은 모든 척수증식성 질환 또는 이의 예측되는 존재에 대해 맨 먼저 고려되어야 한다. 이러한 검출은 척수증식성 질환을 확인하기 위한 어떠한 생물학적 테스트도 존재하지 않는 만성 혈소판증식증에 있어서 특히 중요할 것이다. 또한, 이는 골수섬유증의 진단 및 확인되지 않은 병인의 혈전증에 걸린 임상적 상황에 있어서 중요한 테스트가 될 것이다. 따라서, 본 발명은 최초로 PV 및 이의 돌연변이와 관련이 있는 척수증식성 질환의 진단 기술을 제공하며, 이를 표적 치료하기 위한 방법을 열었다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 적혈구증가증에 맨 먼저 시도되어야 하고, 대부분의 환자 및 만성 적혈구증가증에서 적혈구 중량 및 내인성 적혈구 콜로니(EEC)의 정량뿐만 아니라 골수 테스트를 하지 않아도 되게 함으로써 병인을 오랫동안 찾지 않아도 되게 하는 진단 테스트로서 JAK2 V617F 돌연변이의 검출을 제안한다.