유전자 전달을 위한 생물분해성 교차-연결된 양이온성다중-블록 공중합체 및 이의 제조 방법 document_id A220623052235

유전자 요법의 성공은 치료 유전자를 표적 조적으로 안전하고 효율적으로 전달하는 유전자 전달 시스템의 능력에 좌우된다. 유전자 전달 시스템은 바이러스 시스템과 비-바이러스(또는 플라스미드 DNA-기초된) 시스템으로 구분될 수 있다. 현재 임상적으로 이용되고 있는 유전자 전달 기술은 이들이 고유의 화학적, 생화학적, 분자생물학적 특징을 통하여 표적 세포를 형질감염 또는 감염시키는 능력을 보유한다는 점에서, 1세대로서 간주될 수 있다. 하지만, 이와 같은 유일한 특성에 대한 의존은 이들의 치료 적용을 제한한다. 가령, 포유동물 세포를 감염시키는 능력을 가진 바이러스는 높은 형질도입 효율로, 유전자 전달에 효과적으로 이용된다. 하지만, 임상적 상황에 이용되는 경우에, 심각한 안정성 문제(가령, 숙주에 의한 강한 면역반응 및 돌연변이유발의 잠재성)가 제기된다. “나신 DNA” 또는 제조된 플라스미드 DNA에 기초한 비-바이러스 유전자 전달 시스템은 이용의 간편함 및 특이적인 면역반응의 부재로 인하여, 바이러스 벡터보다 잠재적으로 유익하다. 나신 DNA의 한계를 극복하는 다수의 합성 유전자 전달 시스템, 예를 들면, 양이온성 지질, 펩티드, 중합체가 보고되었다. 초기의 낙관에도 불구하고, 양이온성 지질-기초된 시스템의 임상적 적합성(clinical relevance)은 이들의 낮은 효율, 독성, 저항성(refractory nature)으로 인하여 제한된다. 다른 한편, 중합체는 그들의 우수한 분자 적응성(molecular flexibility)이 복잡한 변형 및 신규한 화학적 성질의 통합을 가능하게 하기 때문에, 현재의 시스템에 대한 유망한 대안으로서 부상하였다. 양이온성 중합체, 예를 들면, 폴리(L-리신)(PLL), 폴리(L-아르기닌)(PLA), 폴리에틸렌이민(PEI)은 DNA를 압축시키고 DNA 안정성과 막통과 전달을 촉진하는 능력으로 인하여 유전자 전달 후보로서 광범위하게 연구되었다. 양이온성 중합체의 형질감염 효율은 분자량에 의한 영향을 받는다. 고분자량, 003e#20 kD의 중합체는 저분자량 중합체보다 더욱 우수한 형질감염 효율을 나타낸다. 아이러니컬하게도, 고분자량을 갖는 중합체들은 세포독성 역시 훨씬 강하다. 이런 문제를 우회하고 세포독성을 증가시키지 않으면서 양이온성 중합체의 형질감염 활성을 개선하려는 여러 시도가 있어왔다. 가령, Lim 등은 용융 축합(melting condensation)으로, 분해성 중합체, 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산](PAGA)을 합성하였다(Pharm. Res. 17:8 11-816, 2000). PAGA가 일부 유전자 전달 연구에서 사용된 적이 있긴 하지만, 이의 실질적인 적용은 낮은 형질감염 활성 및 수용액에서 불량한 안정성으로 인하여 제한된다(J Controlled. Rel. 88:33-342, 2003; Gene Ther. 9:1075-1084, 2002). 하이드록시프롤린(PHP) 에스테르와 망상으로 연결된 폴리(아미노 에스테르)는 분해성 중합체의 다른 실례이다. PHP 에스테르는 용융 축합 또는 디사이클로헥실카보디이미드(디메틸-아미노)피리딘 (DCC/DMAP)-활성화된 중축합(polycondensation)에 의해 Cbz-4-하이드록시-L-프롤린으로부터 합성되었다(J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Macromolecules 32:3658-3662, 1999). 망상으로 연결된 폴리(아미노 에스테르)(n-PAE)는 비스(2-메톡시-카르보닐에틸)[트리스-(하이드록시메틸)메틸]아민의 하이드록실기와 카르복실기 사이에 벌크 중축합(bulk polycondensation), 이후, 6-(Fmoc-아미노)헥사논산과의 축합에 의해 합성되었다(Bioconjugate Chem. 13:952- 957, 2002). 이들 폴리에스테르는 DNA를 축합시키고 시험관내에서 낮은 세포독성으로 세포를 형질감염시키긴 하지만, 수용액 내에서 이들의 활성이 불량하다. 폴리(에틸렌이민)(PEI)은 DNA를 작고 좁게 분포되며 양으로 하전된 구형 복합체로 축합시키고, 시험관내와 생체내에서 세포를 형질감염시킬 수 있다. PEI는 PEI의 형질감염 활성이 중합체/DNA가 증가함에 따라 증가한다는 점에서, 다른 양이온성 중합체와 유사하다. PLL에 비하여 PEI의 분명한 이점은 PEI가 높은 형질감염 효율을 나타낼 수 있도록 하는 이의 엔도소몰리틱 활성(endosomolytic activity)이다. 상업적으로 구입가능한 가지형 PEI는 25% 일차 아민, 50% 이차 아민, 25% 삼차 아민으로 구성된다. PEI의 전체 양성자화(protonation) 수준은 pH 7에서 pH 5로 2배 증가하는데, 이는 엔도솜(endosome) 내에서 PEI가 심하게 양성자화된다는 것을 의미한다. PEI의 양성자화는 엔도솜 막을 교차하는 염화물 유입(chloride influx)을 유인하고, 뒤이어 물이 엔도솜 내에서 높은 이온 농도를 상쇄시키는데, 이는 궁극적으로, 삼투 팽창(osmotic swelling)으로부터 엔도솜 파괴 및 포획된 DNA의 방출을 유도한다. 고유한 엔도소몰리틱 활성으로 인하여, PEI는 일반적으로, 형질감염을 위한 엔도소몰리틱 작용제의 추가를 요구하지 않는다. 이들 이점으로 인하여, PEI는 더욱 안전하고 효율적인 전달 시스템을 산출하기 위한 중합체 기능체화 전략에서 더욱 빈번하게 사용되고 있다. PEI의 세포독성과 형질감염 활성은 중합체의 분자량과 선형적으로 관련된다. 세포독성을 증가시키지 않으면서 PEI 형질감염 활성을 증가시키기 위하여, Ahn 등은 아마이드 연결을 통하여 소분자량 가지형 PEI 블록을 PEG 분자로 공유 연결시킴으로써 고분자량 다중-블록 공중합체를 합성하였다(J Control Release 80:273-282, 2002; Us. Patent No.6652886). 이들 다중-블록 공중합체는 수용액 내에서 난용성이고, 형질감염 활성에서 단일 블록 중합체보다 다소 우월하다(최대 3배). 본 발명의 간단한 설명 본 발명은 선형 폴리(알킬렌이민)(LPAI)과 친수성 링커의 생물분해성 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체를 제시하는데, 여기서 LPAI 블록은 친수성 링커에 의해, 생물분해성 에스테르 결합, 아마이드 결합, 이황화 결합, 또는 인산염 결합으로 서로 교차 연결된다. 적절하게는, 선형 폴리(알킬렌이민)(LPAI)은 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-β-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘에서 선택된다. 더욱 적절하게는, 선형 폴리(알킬렌이민)(LPAI)은 선형 폴리(에틸렌이민)(LPEI)이다. 본 발명의 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체는 생물분해성 링커에 의해, 다른 모이어티(moiety), 예를 들면, 형광 마커, 지질 앵커 또는 이들의 유도체, 다시 말하면, 콜레스테롤, 지방산 또는 이들의 유도체에 선택적으로 연결될 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 사용되는 선형 PEI의 분자량은 1000 내지 25000 달톤(Dalton)의 범위 내에 있다. 적절하게는, 선형 PEI 블록은 생물분해성 이황화이산(disulfidediacid)-유래된 링커, 다시 말하면, 디티오디프로피온산염(dithiodipropionate) 유도체를 이용한 디아마이드(diamide) 연결을 통하여 서로 연결된다. 적절하게는, 링커 : PEI의 몰 비율은 1/1 내지 5/1의 범위 내에 있다; 적절하게는, 지질 앵커 : PEI의 몰 비율은 0/1 내지 3/1의 범위 내에 있다. 본 발명의 중합체는 가급적, 염화물 반대이온으로 폴리암모늄 염으로서 제조된다. PEI의 독성이 분자량 증가에 비례하여 증가하기 때문에, 본 발명의 중합체 내에 블록으로서 더욱 적은 분자량 PEI의 사용은 포유동물 세포의 형질감염 및 유전자 요법의 생체내 적용을 위한 보편적인 반응물로서 사용하기 적합한 개선된 유전자 담체(gene carrier)를 제공한다. 본 발명의 생물분해성 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체는 핵산을 포함하는 분리된 나노미터-크기 입자를 자발적으로 형성할 수 있는데, 이는 리포펙타민TM과 단순한 폴리에틸렌이민에 의해 통상적으로 달성될 수 있는 것보다 더욱 효율적으로 포유동물 세포주 내로의 유전자 형질감염을 촉진한다. 본 발명의 생물분해성 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체는 동물 세포 내로 통합된 이후, 물질대사에 의해 쉽게 분해된다. 게다가, 본 발명의 생물분해성 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체는 수용성 교질입자 용액을 형성할 수 있는데, 이는 다양한 생물활성제, 예를 들면, DNA의 전신 전달에 특히 유용하다. 더 나아가, 본 발명은 형질감염 제제를 제시하는데, 이는 생체내와 시험관내 형질감염 모두에 효과적인 최적 전하 비율(charge ratio)(지질중합체의 양전하/핵산의 음전하)로, 선택된 핵산과 복합된 생물분해성 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체를 함유한다. 또한, 본 발명은 공유 연결된 형광단(fluorophore)(가령, 로다민)으로 인하여 형광 검경에 의해 가시화될 수 있는 형질감염 반응물을 제시하고, 따라서 중합체 및 이러한 중합체와 음이온성 작용제의 복합체의 세포 분포와 전달(trafficking)을 가시화시키는 도구를 제시한다. 또한, 본 발명은 황산염 형태로 선형 폴리에틸렌이민(PEI)의 합성을 위한 합성 절차를 제시한다. 또한, 본 발명은 핵산 또는 다른 음이온성 생물활성제를 축합시키고 생리 조건하에 안정적인 복합체를 형성할 수 있는 생물분해성 수용성 교차-연결된 양이온성 다중-블록 공중합체에 대한 제조 절차를 제시한다. 또한, 본 발명은 특수한 추적물질, 다시 말하면, 형광 마커 또는 일부 다른 기능체화된 리간드를 보유하는 생물분해성 수용성 다중-블록 공중합체에 대한 제조 절차를 제시한다. 이들 중합체는 핵산 또는 다른 음이온성 생물활성제를 축합시키고 생리 조건하에 안정적인 복합체를 형성할 수 있는데, 이는 분석과 연구 작업에서 부가적인 이점을 제공한다.